1. Почетно разбирање

Во оваа фаза, треба да разбереме некои концепти и терминологија, за да избегнеме да правиме грешки пред нашите постари лица, како што се:

П: Која е разликата помеѓу RT-PCR, qPCR, PCR во реално време и RT-PCR во реално време?

Одговор: RT-PCR е PCR со обратна транскрипција(ПЦР со обратна транскрипција, RT-PCR), која е широко користена варијанта на полимеразна верижна реакција (PCR).Во RT-PCR, нишката на РНК е обратно транскрибирана во комплементарна ДНК, која потоа се користи како образец за засилување на ДНК со PCR.
Во реално време-PCR и qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) се иста работа, и двете се квантитативни PCR во реално време, што значи дека секој циклус на PCR има записи со податоци во реално време, така што бројот на почетни шаблони може да се прилагоди прецизна анализа.

Иако и во реално време PCR (во реално време флуоресцентна квантитативна PCR) и обратна транскрипција PCR (реверзна транскрипција PCR) се чини дека се скратени како RT-PCR, меѓународната конвенција е: RT-PCR конкретно се однесува на обратна транскрипцијаPCR, PCR во реално време е генерално скратено како qPCR (квантитативна PCR во реално време).

И RT-PCR во реално време (RT-qPCR), тоа е PCR за обратна транскрипција во комбинација со флуоресцентна квантитативна технологија: прво да се добие cDNA (RT) од обратна транскрипција на РНК, а потоа да се користи PCR во реално време за квантитативна анализа (qPCR).Повеќето лаборатории прават RT-qPCR, односно истражување на регулација на експресија на РНК, така што qPCR за кој сите зборуваат во лабораторија всушност се однесува на RT-qPCR, но не заборавајте дека сè уште има многу ДНК тестови во клиничките апликации.Квантитативна анализа, како што е откривање на ХБВ вирусот на хепатитис Б.

Прашање: По читањето на многу флуоресцентни квантитативни PCR, зошто засилениот фрагмент треба да се контролира во опсег од 80-300bp?

Одговори: Должината на секоја генска секвенца е различна, некои се неколку kb, некои се стотици bp, но потребно е само да бараме должината на производот да биде 80-300bp кога дизајнираме прајмери, премногу кратки или предолги не се погодни за флуоресцентно квантитативно PCR откривање.Фрагментот на производот е премногу краток за да се разликува од прајмер-димерот.Должината на прајмер-димерот е околу 30-40bp и тешко е да се разликува дали е прајмер-димер или производ ако е помал од 80bp.Ако фрагментот на производот е премногу долг, надминувајќи 300 bp, лесно ќе доведе до ниска ефикасност на засилување и не може ефикасно да ја открие количината на генот.

На пример, кога броите колку луѓе има во училница, треба само да изброите колку усти има.Истото важи и кога детектирате гени, потребно е само да откриете одредена секвенца од ген за да ја претставите целата секвенца ќе го направи тоа.Ако сакате да ги броите луѓето, треба да ги броите и устата и носот, ушите и очилата, а лесно е да се прават грешки.

За да се прошири, во биолошкото истражување, има многу истражувачки случаи од точка до област, бидејќи генската секвенца на кој било вид е многу долга, непотребно и невозможно е да се измерат сите фрагменти, како што е бактериското секвенционирање 16S, што е да се изврши конзервативната низа на бактерии Анализи за да се заклучи бројот на одредена популација на бактерии.

П: Која е оптималната должина за дизајн на прајмер qPCR?

Одговори: Општо земено, должината на прајмерот е околу 20-24bp, што е подобро.Секако, при дизајнирање на прајмерот мора да внимаваме на вредноста ТМ на прајмерот, бидејќи тоа е поврзано со оптималната температура на жарење.По многу експерименти, докажано е дека 60°C е подобра TM вредност.Ако температурата на жарење е премногу ниска, тоа лесно ќе доведе до неспецифично засилување.Ако температурата на жарење е превисока, ефикасноста на засилување ќе биде релативно ниска, врвот на кривата на засилување ќе започне подоцна, а вредноста на КТ ќе биде одложена.

П: Како методот на боја се разликува од методот на сонда?

Одговор: Метод на бојаНекои флуоресцентни бои, како што се SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, итн., не испуштаат светлина сами по себе, но ќе испуштаат флуоресценција откако ќе се врзат за малиот жлеб на двоверижна ДНК.Затоа, на почетокот на реакцијата на PCR, машината не може да го открие флуоресцентниот сигнал.Кога реакцијата ќе достигне фаза на жарење-продолжување, двојната жичка се отвора и се синтетизира нова нишка под дејство на ДНК полимераза, а флуоресцентната молекула се врзува за помалиот жлеб dsDNA.Како што се зголемува бројот на циклуси на PCR, се повеќе и повеќе бои се комбинираат со двоверижна ДНК, а флуоресцентниот сигнал исто така постојано се подобрува.Методот на боја главно се користи во научните истражувања.
PS: Внимавајте кога го правите експериментот, бојата мора да се комбинира со човечка ДНК, внимавајте да ја претворите во флуоресцентна личност.

Метод на боја (лево) Метод на сонда (десно)
PS: Внимавајте кога го правите експериментот, бојата мора да се комбинира со човечка ДНК, внимавајте да ја претворите во флуоресцентна личност.

SYBR Green Ⅰ се врзува за малиот жлеб на ДНК

Метод на сондаСондата Taqman е најчесто користена сонда за хидролиза.Постои флуоресцентна група на 5' крајот на сондата, обично FAM, а самата сонда е секвенца комплементарна на целниот ген.На крајот од 3′ има флуоресцентна група за гаснење.Според принципот на пренос на енергија на флуоресцентна резонанца (Ферстер трансфер на енергија од резонанца, FRET), кога известувачката флуоресцентна група (донаторска флуоресцентна молекула) и флуоресцентната група за гаснење (акцепторна флуоресцентна молекула) се возбудени Кога спектрите се преклопуваат и растојанието од 7.10 е многу блиску. флуоресценцијата на акцепторната молекула, додека автофлуоресценцијата е ослабена.Затоа, на почетокот на реакцијата на PCR, кога сондата е слободна и недопрена во системот, репортерската флуоресцентна група нема да емитува флуоресценција.При жарење, прајмерот и сондата се врзуваат за шаблонот.За време на фазата на продолжување, полимеразата континуирано синтетизира нови синџири.ДНК полимеразата има 5'-3' егзонуклеазна активност.Кога ќе стигне до сондата, ДНК полимеразата ќе ја хидролизира сондата од шаблонот, ќе ја оддели репортерната флуоресцентна група од флуоресцентната група за гаснење и ќе го ослободи флуоресцентниот сигнал.Бидејќи постои врска еден-на-еден помеѓу сондата и шаблонот, методот на сонда е супериорен во однос на методот на боја во однос на точноста и чувствителноста на тестот.Методот на сонда главно се користи во дијагнозата.

П: Што е апсолутна квантификација?Што е релативна квантификација?

Одговори: Апсолутна квантификација се однесува на пресметката на почетниот број на копии на примерокот што треба да се тестира со qPCR, како на пример колку вируси на ХБВ има во 1 ml крв.Резултатот добиен со релативна квантификација е промената на количината на целниот ген во специфичен примерок во однос на друг референтен примерок, а генската експресија е нагоре регулирана или надолу регулирана.

П: Дали количината на екстракција на РНК, ефикасноста на обратна транскрипција и ефикасноста на засилување ќе влијаат на експерименталните резултати?
П: Дали складирањето примероци, реагенсите за екстракција, реагенсите за обратна транскрипција и потрошниот материјал што пренесува светлина ќе влијаат на експерименталните резултати?
П: Кој метод може да ги коригира експерименталните податоци?

Во врска со овие прашања, ќе ги опишеме детално во напредните и напредните делови подолу.
2. Напредно знаење

Во однос на флуоресцентната квантитативна PCR во реално време, мора да ја препознаеме реалноста дека секоја година се објавуваат илјадници научно-истражувачки трудови, меѓу кои технологијата на флуоресцентна квантитативна PCR не е мала бројка.

Ако не постои заеднички стандард за мерење на флуоресцентниот квантитативен ПЦР експеримент, резултатите може многу да се разликуваат.За ист ген од ист вид, со истиот метод на обработка, резултатите од детекцијата исто така ќе се разликуваат во голема мера, а за доцните ќе биде тешко да ги повторат истите резултати.Вие Никој не знае што е правилно, а кое не.

Дали ова значи дека флуоресцентната квантитативна PCR е технологија за измама или несигурна технологија?Не, тоа е затоа што флуоресцентната квантитативна PCR е почувствителна и попрецизна, а малку погрешна операција ќе даде сосема спротивни резултати.Мала загуба е илјада милји подалеку.Авторот на статијата може постојано да биде измачуван од рецензентите.Во исто време, на рецензентите на списанието исто така е тешко да се изберат од различни експериментални резултати.

Сè на сè, што укажува на недостаток на консензус во експериментите со PCR во реално време.За таа цел, високи научници во индустријата почнаа да формулираат стандарди,барајќи од соработниците да обезбедат некои неопходни експериментални детали и детали за обработка на податоци (вклучувајќи ги и потребните податоци) во статијата за да се исполнат овие стандарди.

Рецензентите можат да го проценат квалитетот на експериментот со читање на овие детали;идните читатели исто така можат да го користат ова за да го повторат експериментот или да го подобрат експериментот.Тогаш експерименталните резултати добиени на овој начин се полни со информации, квалитетни и употребливи.

MIBBI (минимум информации за биолошки и биомедицински испитувања -http://www.mibbi.org) настанала.MIBBI е проект кој обезбедува стандарди за експерименти.Се објавува во природа.Овој проект е насочен кон различни биолошки експерименти, вклучително и клеточна биологија, Microarray, qPCR за кои ќе разговараме сега итн., и предвидува секој тип на експеримент при поднесување ракописи.Тие информации треба да се даваат во секое време.

Во проектот MIBBI, постојат два написи поврзани со флуоресцентна квантитативна PCR, имено:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – структуриран јазик и водич за известување за квантитативни PCR податоци во реално време;
·MIQE (минимални информации за објавување на квантитативни експерименти со PCR во реално време) – минимални информации за објавување написи за квантитативни експерименти со PCR во реално време.
Прво, ајде да зборуваме за RDML, терминолошката спецификација.

Ако не постои стандардна дефиниција за сè, невозможно е да се продолжи дискусијата, поради што објаснувањето на поимите е толку важно на испитот.
Терминологијата што се користи во експериментот со флуоресцентна квантитативна PCR ја вклучува следната содржина.QIAGEN го направи најдоброто резиме за нас.Следниве се сите сувистоки .

Крива на засилување
Кривата на засилување се однесува на кривата направена за време на процесот на PCR, со бројот на циклусот како апсциса и интензитетот на флуоресценција во реално време за време на реакцијата како ордината.

Одлична крива на засилување треба да ги има следните карактеристики: основната линија е рамна или благо намалена и нема очигледен нагорен тренд;точката на флексија на кривата е јасна, а наклонот на експоненцијалната фаза е пропорционален на ефикасноста на засилување.Колку е поголем наклонот, толку е поголема ефикасноста на засилување;целокупната крива на засилување Паралелизмот е добар, што покажува дека ефикасноста на засилување на секоја цевка е слична;очигледна е експоненцијалната фаза на кривата на засилување кај примероците со мала концентрација.

Основна линија (основна линија)
Основната линија е нивото на бучава на раниот циклус, обично се мери помеѓу 3-тиот и 15-тиот циклус, бидејќи зголемувањето на вредноста на флуоресценцијата предизвикано од производот за засилување не може да се открие во овој период.Бројот на циклуси што се користат за пресметување на основната линија може да варира и можеби ќе треба да се намали ако се користат високи количини на шаблон или ако нивото на изразување на целниот ген е високо.

Поставувањето на основната линија бара прегледување на податоците за флуоресценција од кривата на засилување на линеарноста.Основната линија е поставена така што растот на кривата на засилување започнува со број на циклус поголем од горниот број на основниот циклус.Основните линии треба да се постават поединечно за секоја целна низа.Просечните вредности на флуоресценција откриени во раните циклуси треба да се одземат од вредностите на флуоресценција добиени во засилените производи.Најновите верзии на различни софтвери за PCR во реално време овозможуваат автоматска оптимизација на основните поставки за поединечни примероци.

Во текот на првите неколку циклуси на реакцијата на засилување на PCR, флуоресцентниот сигнал не се менува многу.Приближувањето до права линија се нарекува основна линија, но ако внимателно ги погледнеме првите неколку циклуси, ќе видиме дека во основната линија е она што се случува на сликата подолу.

Заднина Позадина се однесува на
неспецифичната флуоресцентна вредност во реакцијата.На пример: неефикасно гаснење со флуоресценција;или голем број двоверижни шаблони на ДНК поради употребата на SYBR Green.Позадинските компоненти на сигналот се математички отстранети со софтверскиот алгоритам за PCR во реално време.

Сигнал на репортер
Сигналот на известувачот се однесува на флуоресцентниот сигнал генериран од SYBR Green или флуоресцентно означени сонди специфични за секвенца за време на PCR во реално време.

Нормализиран сигнал за известувач (RN)
RN се однесува на интензитетот на флуоресценција на репортерната боја поделен со интензитетот на флуоресценција на пасивната референтна боја измерен на секој циклус.

Пасивна референтна боја
Во некои PCR во реално време,флуоресцентната боја ROX се користи како внатрешна референца за нормализирање на флуоресцентниот сигнал.Ги коригира варијациите поради неточна пипетирање, положбата на бунарот и флуктуациите на флуоресценцијата на база бунар до бунар.

Праг на флуоресценција (праг)
беше прилагодена над вредноста на позадината и значително под плато вредноста на кривата на засилување.Таа мора да лежи во линеарниот регион на кривата на засилување, што го претставува лог-линеарниот опсег на PCR детекција.Праговите треба да се постават во приказот на кривата на лог-засилување, така што лог-линеарната фаза на PCR е лесно препознатлива.Ако има повеќе целни гени во PCR во реално време, прагот мора да се постави за секоја цел.Општо земено, флуоресцентниот сигнал од првите 15 циклуси на PCR реакција се користи како сигнал за флуоресценција на позадината, а прагот на флуоресценција е 10 пати поголем од стандардното отстапување на флуоресцентниот сигнал од првите 3 до 15 циклуси на PCR, а флуоресцентната фаза е поставена на експресенцијата на фазата на флуоресценција.Општо земено, секој инструмент има свој праг на флуоресценција поставен пред употреба.

Праг на циклусот (CT) или точка на премин (CP)
Циклусот во кој кривата на засилување го преминува прагот (т.е. точката во која детекцијата на флуоресценција значително се зголемува).КТ може да биде дропка и може да се пресмета количината на почетниот шаблон.Вредноста на КТ го претставува бројот на искусени циклуси кога флуоресцентниот сигнал во секоја реакциона цевка на PCR ќе го достигне зададениот праг.Постои линеарна врска помеѓу вредноста на КТ на секој шаблон и логаритамот на бројот на почетната копија на шаблонот,поголем број на почетната копија, толку е помала вредноста на КТ и обратно.Стандардна крива може да се направи со користење на стандард со познат почетен број на копија, каде што апсцисата ја претставува вредноста на КТ, а ординатата го претставува логаритамот на почетниот број на копија.Затоа, сè додека се добива вредноста на КТ на непознатиот примерок, бројот на почетната копија на примерокот може да се пресмета од стандардната крива.

ΔCT вредност
ΔCT вредноста опишуваразликата помеѓу целниот ген и соодветната вредност на КТ на референтниот ендоген ген, како што е генот за домаќинство, и се користи за нормализирање на количината на употребениот шаблон:
⇒ΔCT = CT (целен ген) – КТ (ендоген референтен ген)

ΔΔCT Вредност
Вредноста ΔΔCT ја опишува разликата помеѓу средната вредност ΔΔCT на примерок од интерес (на пр., стимулирани клетки) и средната вредност ΔΔCT на референтниот примерок (на пример, нестимулирани клетки).Референтниот примерок се нарекува и калибрационен примерок и сите други примероци се нормализираат на ова за релативна квантификација:
⇒ΔΔCT = просечен ΔCT (примерок од интерес) – просечен ΔCT (референтен примерок)

Ендогени референтни гени (ендогени референтни гени)
Нивоата на изразување на ендогените референтни гени, како што се гените за одржување на домот (гени за домаќинство), не се разликуваат помеѓу примероците.Споредувањето на вредностите на КТ на референтниот ген со целниот ген овозможува да се нормализира нивото на изразување на целниот ген до количината на влезна РНК или cDNA (видете го делот за вредностите ΔCT погоре).

Внатрешните референтни гени се точни заможна деградација на РНК или присуство на ензимски инхибитори во примероците на РНК, како и варијации во содржината на РНК, ефикасност на обратна транскрипција, обновување на нуклеинската киселина и ракување со примероците.За да го избереме оптималниот референтен ген(и), го модифициравме алгоритмот за да дозволиме избор на оптимална референца во зависност од експерименталната поставка.

Внатрешна контрола
Контролна секвенца која се засилува во истата реакција како целната секвенца и се испитува со различна сонда (т.е. изведување дуплекс PCR).Внатрешните контроли често се користат за да се исклучат неуспешните засилувања, како на пример кога целната секвенца не е откриена.
Примерок за калибрација
Референтен примерок (на пример, прочистена РНК од клеточна линија или ткиво) што се користи во релативна квантификација за да се споредат сите други примероци за да се одреди релативното ниво на изразување на генот.Примерокот за калибрација може да биде кој било примерок, но обично е контролен (на пример, нетретиран примерок или примерок од времето нула на експериментот).

Позитивни контроли
користете контролни реакции сопознати количини на шаблон.Позитивните контроли често се користат за да се провери дали множеството прајмер или комплетот прајмер-сонда работи правилно и дали реакцијата е правилно поставена.

Без контрола на шаблон (NTC)
Контролна реакција која ги содржи сите потребни компоненти на реакцијата за засилување освен шаблонот, кој обично се заменува со вода.Употребата на NTC може да ја открие контаминацијата предизвикана од контаминација со реагенс или туѓа ДНК, со што се обезбедува автентичноста и веродостојноста на податоците за откривање.Засилувањето на NTC контролата укажува на контаминација.

Нема контрола на RT (NRT)
Процесот на екстракција на РНК може да содржи резидуална геномска ДНК, која е исклучително штетна и е виновникот што влијае на квалитетот на податоците и природниот непријател на qPCR, така што кога се дизајнираат експерименти, тој мора да биде дизајниран само да ја засилува детекцијата на РНК.Постојат два начина, едниот е да се дизајнираат прајмери ​​низ интроните, другиот е целосно да се отстрани ДНК, кој е подобар, што ќе се дискутира подоцна.Контролата NTR е магично огледало за откривање на загаденоста на ДНК.Ако има засилување, тоа значи дека има загадување.

Стандарди
Стандардите се примероци со позната концентрација или број на копии кои се користат за конструирање стандардна крива.Со цел да се обезбеди стабилност на стандардот, генскиот фрагмент обично се клонира во плазмидот и се користи како стандард.

Стандардната крива
обично се разредува во најмалку 5 градиенти на концентрација со стандардниот производ според односот на удвојување, а 5 точки се цртаат во координатите на вредноста на КТ и бројот на копијата, а точките се поврзани за да формираат линија за да се генерира стандардна крива.За секоја стандардна крива треба да се провери нејзината валидност.Вредноста на наклонот паѓа помеѓу –3,3 и –3,8, а секоја концентрација се изведува во три примероци.Точките кои се значително различни од другите точки треба да се отфрлат.Вредноста на КТ на примерокот што треба да се тестира се внесува во стандардната крива и може да се пресмета нивото на изразување на примерокот што треба да се тестира.

Вредноста на КТ на примерокот што треба да се тестира се внесува во стандардната крива и може да се пресмета почетниот број на копија на примерокот што треба да се тестира.

Ефикасност и наклон
Наклонот на стандардната крива ја претставува ефикасноста на PCR во реално време.
· Наклон од -3,322 покажува дека ефикасноста на засилување на PCR е 1, или 100% ефикасна, а количината на PCR производ се удвојува на секој циклус.
· Наклон помал од -3,322 (на пр., -3,8) укажува на ефикасност на PCR
· Наклон поголем од –3,322 (на пример, –3,0) покажува дека ефикасноста на PCR се чини дека е поголема од 100%, што е чудно, како еден циклус на PCR може да генерира повеќе од двојно повеќе од засилениот производ?Оваа ситуација се јавува во нелинеарната фаза на PCR реакцијата, односно има голема количина на неспецифично засилување.

крива на топење
По завршувањето на qPCR засилувањето, PCR производот се загрева.Како што се зголемува температурата, производот за засилување со двојно жица постепено се топи, што резултира со намалување на интензитетот на флуоресценцијата.Кога ќе се достигне одредена температура (Tm), ќе се стопат голем број производи.Флуоресценцијата нагло паѓа.Различни производи на PCR имаат различни вредности на Tm и различни температури на топење, така што може да се идентификува специфичноста на PCR.

Крива на топење (изводна крива)
Кривата на топење е изведена за да формира мапа на врвот, која може поинтуитивно да ја прикаже ситуацијата на фрагментите на PCR производ.Бидејќи температурата на топење е вредноста на Tm на фрагментот на ДНК, може да се проценат некои параметри кои влијаат на вредноста на Tm на фрагментот на ДНК, како што се големината на фрагментот, содржината на GC итн. Општо земено, според нашите принципи за дизајн на прајмер,должината на засилениот производ е во опсег од 80-300bp, така што температурата на топење треба да биде помеѓу 80°C и 90°C.

Интерпретација на кривата на топење: Ако единствениот главен врв се појавува помеѓу 80°C-90°C, тоа значи дека флуоресцентната квантитативна PCR е совршена;ако главниот врв се појавува помеѓу 80°C-90°C, а различни врвови се појавуваат под 80°C, во основа се зема предвид димерот на прајмерот.Може да се обидете да ја зголемите температурата на жарење за да го решите;ако главниот врв се појавува помеѓу 80°C-90°C, а различниот врв повторно се појавува кога температурата се зголемува, во основа се смета дека има контаминација на ДНК и ДНК треба да се отстрани во почетната фаза од експериментот.

Секако, има уште некои ненормални ситуации, кои подолу ќе бидат расчленети една по една.
3. Напредно знаење

За да направам qPCR, морам да кажам MIQE,Минимални информацииза објавување наКвантитативниПЦР во реално времеЕксперименти — минималните информации за објавување написи за квантитативна PCR во реално времеексперименти.За да го поедноставиме разбирањето на сите, ќе ја поедноставиме клучната содржина.

Оригиналниот текст на MIQE можете да го пребарувате на интернет, а најважно е што предвидувалиста за проверка на податоци што треба да се обезбеди при објавување на статија .

Рецензентите можат да го проценат квалитетот на експериментот со читање на овие детали;идните читатели исто така можат да го искористат ова за да го повторат или подобрат експериментот.
Вреди да се напомене дека во оваа листа важноста на секоја листа е означена со Е или Д соодветно.Што значи тоа?Д: суштински информации (мора да се достават);Д: пожелни информации (обезбедете што е можно повеќе).

MIQE (1) - Експериментален дизајн
Многу ѓубриња кои ја завршиле својата одбрана по завршувањето на постдипломските студии нема да знаат како самостојно да дизајнираат експеримент, да ги отворат своите тетратки и да го прават тоа што ќе им каже наставникот.Како резултат на тоа, експерименталниот дизајн не беше ригорозен, а редакцискиот оддел на списанието рече дека сакале да ја измислат оваа и таа слика, па го направиле тоа зашеметено.Вака се прават ѓубрињата!

Поблиску до дома, првиот принцип на експериментот е да се утврдистрогоста на експерименталната логика.Најфундаменталното нешто е експерименталниот дизајн, а најважното нешто за експерименталниот дизајн е како да се постави целниот примерок, референтниот примерок (контрола) и бројот на повторувања, така што експерименталните податоци можат да бидат референтни, споредливи и убедливи.

Целниот примероксе однесува на примерокот кој бара од нас да го откриеме целниот ген по одреден третман.Референтниот примероке примерокот без никаков третман, кој често се нарекува див тип во биологијата.

Експериментални репликисе многу важни.Општо земено, бројот на убедливи реплики мора да биде повеќе од три.Неопходно е да се направи разлика што е биолошка репликација, а што е техничка репликација.

Биолошки реплики: Истиот експеримент за верификација направен со различни материјали (време, растенија, серии, реакциони плочи).

Биолошко дуплирање
Да го земеме како пример пестицидниот третман на пиперката.Сакаме да прскаме пестициди на трите растенија на ABC, тогаш трите растенија на ABC се три биолошки реплики, и тие се ист експеримент за верификација спроведен со различни материјали.Но, како експеримент, дефинитивно е потребна контрола, така што можеме да испрскаме една од гранките на растението А за да формираме експериментална група од растението А, а не да ги прскаме другите гранки на растението А за да формираме контролна група.Направете го истото за Б и Ц.

Технички реплики (Технички реплики): Тоа е повторен експеримент дизајниран за да се избегнат грешките предизвикани од работата, што всушност е дупликат дупка вклучена во истиот материјал.И третманите и контролите мора да имаат реплицирани поставки (минимум три) на целниот ген и внатрешниот референтен ген.

Техничко повторување
Повторно земете ја пиперката третирана со пестициди како пример.За експерименталната група на растението А, направивме три PCR дупки од 1, 2 и 3 за целниот ген и внатрешниот референтен ген соодветно, за да се земе просекот по откривањето.За контрола на растението А Групите исто така се третираат на ист начин.Слично, направете го истиот третман за растенијата Б и Ц.Ова е техничко повторување.

Вреди да се напомене декаона што влегува во статистиката е биолошкото повторување, а техничкото повторување е да се тестира дали има некои случајни појави во експерименталниот процес, за да се направат експерименталните резултати веродостојни, односно да се избегнат грешките земајќи го нивниот просек како што често велиме.

Негативни контроли-NTC и NRT
NTC (Контрола без шаблони), контрола без шаблон, се користи за да се потврди дали експерименталниот материјал е контаминиран.Општо земено, водата се користи како шаблон.Ако има флуоресцентна реакција, тоа покажува дека во лабораторијата се случила контаминација со нуклеинска киселина.

Овие загадувања доаѓаат од: нечиста вода, неквалификувани реагенси кои содржат ендогена ДНК, загадување со прајмер, загадување на лабораториска опрема, загадување со аеросоли итн., треба да се користат средства за чистење на RNase и инхибитори на RNase.Најтешко е да се најде аеросол загадувањето.Замислете вашата лабораторија е како смог, со разни нуклеински киселини суспендирани во воздухот.

NRT (без обратна транскриптаза), контролата без обратна транскрипција, е нереверзно транскрибирана РНК како негативна контрола, која е контрола на остатоците од gDNA.

Кога се врши генска експресија, количината на РНК се открива со откривање на количината на cDNA по обратна транскрипција.Ако има остаток од gDNA кога РНК се прочистува, тоа ќе предизвика грешки во експерименталните резултати, бидејќи вистинските добиени резултати се gDNA и cDNA.На агрегатно ниво, не само на cDNA, gDNA треба целосно да се отстрани при екстракција на РНК.

MIQE (2) - примерок на информации
Таканаречените информации за примерок значи дека кога објавуваме статија за qPCR, мора јасно да ги објасниме информациите за примероците, што е незаменлив дел од статијата.Слично на тоа, кога обработуваме примероци, мора да ги регулираме и нашите сопствени операции за да ја обезбедиме валидноста на примероците.

Описот на примерокот е само резултат и треба да обрнеме повеќе внимание на материјалите земени во текот на целиот експеримент.

Избор на експериментални материјали
Примероци од крв - изберете свежа крв, не повеќе од 4 часа.Мостри од клетки - изберете да собирате свежи клетки во период на силен раст.Животинско ткиво - изберете свежо ткиво што енергично расте.Растително ткиво - Изберете свежо, младо ткиво.

Сигурно сте забележале дека во овие неколку реченици има клучен збор: свежо .
За горенаведените примероци, најдобриот, економичен и стабилен комплет на пазарот е комплетот на Foregene, кој може брзо и лесно да ги извлече нивните ДНК и РНК.

Мини комплет за ДНК на крв

Комплет за изолација на тотална РНК на клетките

Комплет за изолација на тотална РНК на животните

Комплет за изолација на тотална РНК на растенијата

Комплет за изолација на тотална РНК на растенијата Плус

Комплет за изолација на ДНК на растенијата

Складирање на експериментални материјали
Општо земено, не препорачуваме складирање на примероци, доколку условите дозволуваат.Сепак, има многу пријатели кои не можат да спроведат експерименти веднаш по земање мостри, а некои дури треба да носат резервоари со течен азот на теренот за земање примероци.

За ваков вреден пријател, можам само да кажам дека не ги разбирате потрошните материјали за реагенси.Сега многу компании за потрошни реагенси произведуваат реагенси кои можат да складираат примероци од РНК на собна температура, а вие можете да изберете да ги користите.Конвенционалниот метод на складирање е складирање на течен азот, користејќи мал резервоар за течен азот кој е лесен за носење.Откако ќе го вратите примерокот во лабораторија, чувајте го во фрижидер -80°C.

За експерименти кои вклучуваат РНК, мора да се следи принципот од шест збора:ниска температура, без ензими,ибрзо .

Концептот на ниска температура е лесно да се разбере;без ензими, RNase е насекаде во светот во кој живееме (инаку ќе бевте убиени од ХИВ), па како да се избегне RNase кога правите експерименти е многу важен концепт;брзо,Не постои кунг фу на светот што не може да се скрши, само брзината не може да се скрши.

Затоа, во извесна смисла, колку е пократко времето на екстракција, толку е подобар комплетот.ЗоштоForegeneкомплетот ја нагласува брзината, бидејќи добро ја знаат.

П.С.: Некои девојки прават експерименти многу внимателно, но не се толку добри како слем-данк после неколку години работа.Тие чувствуваат дека Бог е неправеден, се жали на другите и бара живот.Всушност, таа не го разбра.Тој не ја заштити добро РНК, а играчот на слем данк беше пргав.Кога го правеше експериментот мислеше дека ќе го заврши слем-данкот со три пати, пет пати и две делби, но експериментот добро го направи.

Забелешка: Побавно, повеќе шанси за инвазија на RNase.Како да се тренирате да бидете брзи?Нема шанси, само вежбајте повеќе.

За различни експерименти и различни примероци, сепак е потребно да се прочита повеќе литература и да се избере соодветен метод за обработка.За процесот на собирање и складирање примероци, MIQE бара тоа да биде јасно напишано во трудот, за да можат рецензентите да ја прегледаат веродостојноста на трудот, а исто така е погодно за зашеметените млади да го повторат вашиот експеримент.

Иако биолошките експерименти се тешки, тие се од високата класа.Ако не сте внимателни, можете да го превртите светот.На пример, правење на САРС во биохемиска криза или правење хибриден ориз за да се спасат 1,3 милијарди луѓе.Сликата подолу е хемиски експеримент, треба да разберете колку сте горди на вашето истражување само гледајќи го неговиот изглед како кур.Заборавете, не го црни.

MIQE (3) – екстракција на нуклеинска киселина.
Екстракцијата на нуклеинска киселина е голем настан и сите експерименти во молекуларната биологија започнуваат со екстракција на нуклеинска киселина.Најпрво, ајде да ја копираме содржината на MIQE за екстракција на нуклеинска киселина.

Гледајќи ја оваа форма, не можете да останете на површината.Формата е догма.За да бидете врвен студент, мора да прашате зошто.Суштинската содржина на оваа табела е: Продолжичистотата, интегритетот, конзистентноста и количината на екстракција на РНК .

Првиот дел одпроцес или инструмент е чекор на екстракција на нуклеинска киселина.Ако користите автоматски екстрактор на нуклеинска киселина за екстракција (напредно, ве молиме контактирајте ме за купување), треба да го наведете името на моделот на инструментот.

Името на комплетот и

треба јасно да се објасни каков комплет е користен за деталите за промената, кои специјални реагенси се додадени или кои специјални операции се направени за другите лесно да го повторат вашиот експеримент.

Некои луѓе додаваат некои специјални реагенси кога вадат специјални примероци, мислејќи дека тоа е нивното тајно оружје и не им кажуваат на другите.Додека го чуваат во тајност, тие исто така ја губат можноста да направат вашата статија да блесне.Не биди паметен, треба да бидеш поискрен од селскиот стар Џанг во научните истражувања, ако сакаш да бидеш паметен, статијата ќе те направи глуп.

мора да го запомни бројот на производот на комплетоткога ќе го нарачате комплетот и ќе ја напишете статијата.Општо земено, има два броја на комплетот: Cat — број на каталог (број на производ, број на артикл), Лот — број на множество производ ( Се користи за да се покаже од која серија доаѓа производот).

Дополнително, CAS бројот често се користи при нарачка на биохемиски реагенси и заедно ќе го популаризирам.Бројот CAS е бројот што го дава Американското хемиско здружение на секој нов хемиски лек.Општо земено, три броја се поврзани со цртичка.CAS број на Рушуи: 7732-18-5.Хемикалии често имаат повеќе псевдоними, но CAS бројот е единствен.Кога нарачувате лек, прво можете да го проверите неговиот CAS број.

Поблиску до дома, зошто мораме јасно да ги опишеме овие работи?Всушност, тоа е исто така да се провери квалитетот на екстракцијата на РНК.Употребата на инструменти и комплети ќе ја направи екстракцијата на РНК поконзистентна.Скалата за екстракција на обичните лаборатории не е голема, а може да се добие со комплети.

Детали за третман со DNase или RNase
Важното прашање на флуоресцентната квантитативна PCR е да се спречи контаминација на ДНК и не експериментирајте ако има контаминација.Затоа, императив е да се наведе процесот што го користевте за обработка на ДНК, со цел да се покаже дека ДНК во експерименталниот процес е целосно и целосно отстранета.претставена со шематски дијаграм.

Шематски дијаграм на РНК и ДНК
Општо земено, методот за отстранување на ДНК е да се третира РНК со ДНаза по екстракција.Сепак, ова се релативно стари методи.Комерцијалните комплети за екстракција на РНК можеа да ја отстранат ДНК за време на процесот на екстракција без додавање на DNase.На пример, серија комплети од Foregene.

Забелешка: Отстранувањето на ДНК при екстракција на РНК е многу опасен меч со две острици, кој ќе го продолжи времето на операција на екстракција на РНК и ќе го зголеми ризикот од деградација на РНК.Во основа, тоа е компромис помеѓу приносот на РНК и чистотата.

Дополнително, количината на DNase додадена во колоната за адсорпција базирана на силика е многу мала и мора да се користи висококвалитетна DNase за да се постигне ефектот.Неоптимизираната DNase не може да се вари брзо и целосно.Ова е тест на техничкото ниво на трговецот.Се разбира, има уште почудни трговци кои се фалат дека ДНК може да се отстрани без DNase.Може да се каже дека секој што се фали дека ДНК може целосно да се отстрани без DNase е хулиган.ДНК е релативно стабилна двоверижна структура и не може да се избрише само со разговор и смеење.

Проценка на контаминација
метод на проценка: детекција на електрофореза, 1% агароза, 6V/cm, 15min, вчитување 1-3 ул.

Квантитативна анализа на нуклеинска киселина
обично се мери со помош на УВ спектрофотометар.Дозволете ми прво да го популаризирам значењето на трите вредности на OD260, OD280 и OD230.
·OD260nm: Тоа е бранова должина на апсорпција на највисокиот врв на апсорпција на нуклеинската киселина, а најдобро измерената вредност се движи од 0,1 до 1,0.Ако не, разредете или концентрирајте ја мострата за да ја доведете во опсег.
·OD280nm: Тоа е бранова должина на апсорпција на највисокиот врв на апсорпција на протеини и фенолни супстанции.
·OD230nm: Тоа е бранова должина на апсорпција на највисокиот врв на апсорпција на јаглехидрати.

Следно, ајде да зборуваме за улогата на секој индикатор.За A260, може да се користи за мерење на приносот на нуклеинска киселина.Кога OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

За чистота, треба да ги погледнеме соодносите што вообичаено ги гледаме: OD260/280 и OD260/230.
· Чиста ДНК: OD260/280 е приближно еднаква на 1,8.Кога е поголемо од 1,9, тоа покажува дека има загадување со РНК, а кога е помало од 1,6, покажува дека има загадување со протеини и феноли.
·Чиста РНК: 1.7
·OD260/230: Без разлика дали е ДНК или РНК, референтната вредност е 2,5.Кога е помало од 2,0, тоа покажува дека има загадување од шеќер, сол и органска материја.

РНК интегритет

Многу е важно да се измери интегритетот на РНК.Општо земено, неопходно е да се направи експеримент со гел за денатурација на РНК за да се провери дали осветленоста помеѓу 28S и 18S РНК е двократна врска.Кога се појавува третата лента 5S, тоа значи дека РНК почнала да се разградува, освен за безрбетниците.

Податоци за проценка на квалитетот на РНК: Покрај горенаведените тестови, постојат и некои понапредни тестови на инструменти во однос на интегритетот на РНК, како што е тестот за интегритет RQI на системот за автоматска електрофореза Experion, кој може да открие дали РНК се разградува невидливо.

Во научните истражувања, флуоресцентната квантитативна PCR е споредба помеѓу целниот ген и внатрешниот референтен ген.Затоа, во процесот на зачувување на примерокот на РНК, екстракција на РНК итн., примарна цел е да се обезбеди интегритет на РНК.

Како интегритетот на РНК влијае на рамнотежата помеѓу целниот ген и внатрешниот референтен ген може лесно да се разбере од сликата подолу.Деградацијата ќе доведе до некомплетност на генот, без разлика дали се работи за некомплетност на внатрешниот референтен ген или некомплетност на целниот ген, тоа ќе има големо влијание врз податоците.

Шематскиот дијаграм на целниот ген и референтниот ген, не смее да биде точен

Тест за инхибиција (дали вредноста на КТ е потисната при висока или ниска концентрација или други услови)

Земајќи ја оваа бројка како пример, Ct вредностите на петте криви се како што следува.Распределбата на CT вредностите помеѓу кривите е нерамномерна, а Ct вредностите се одложени при високи и ниски концентрации, што е случај со PCR инхибиција.

Клучна точка: Во процесот на екстракција на РНК, треба да ги напуштиме заблудите и да воспоставиме точни.

Погрешната идеја е: екстракцијата на РНК го следи само приносот, мислејќи дека колку е поголема количината на добиената РНК, толку подобро.Всушност, кога правиме квантификација, ако бројот на гени не е многу голем, не ни треба многу РНК.Количината на РНК што ја извлекувате е повеќе од доволна.

Точниот концепт е:Екстракцијата на РНК треба да ја следи чистотата, интегритетот и конзистентноста.Чистотата може да обезбеди дека последователната обратна транскрипција не е инхибирана и податоците нема да бидат засегнати од ДНК.Интегритетот обезбедува рамнотежа на целните секвенци и внатрешните референци.Конзистентноста обезбедува стабилно полнење на примерокот.

MIQE (4) – обратна транскрипција
Заблуда: потрагата по поголем волумен на примерокот.
Точен концепт: Следете ја конзистентноста (стабилноста), без оглед на количината на оптоварена РНК, ефикасноста на обратната транскрипција останува конзистентна, осигурувајќи дека разликите во cDNA можат вистински да ги одразуваат разликите во mRNA.
Овој процес го објаснуваме со шематски дијаграм:

Шематски дијаграм на ефикасноста на обратна транскрипција, не се вистинити
Пред сè, треба да ја разбереме разликата помеѓу процесот на обратна транскрипција и процесот на PCR.PCR се подложува на повеќе процеси на загревање и жарење, а целниот фрагмент расте експоненцијално;додека обратната транскрипција го нема овој процес, можеме да замислиме дека обратната транскрипција е всушност еден-на-еден За време на процесот на репликација, исто толку парчиња РНК

колку што има, може да се добијат онолку делови од cDNA Информации, тие треба да се разберат досега, бидејќи фрагментите големи и мали се обратно транскрибирани и невозможно е да се фокусираме на еден фрагмент.И бидејќи количината на РНК е релативно мала, количината на добиената cDNA е исто така релативно мала, за разлика од PCR, која има ефект на засилување, така што во основа е невозможно да се открие.

Резултати од електрофореза на cDNA
Второ, идеално, обратна транскрипција се врши еден-на-еден, но ниту една обратна транскриптаза од која било компанија не може да го постигне овој ефект.Во основа, ефикасноста на повеќето реверзни транскриптази се движи помеѓу 30-50%.Ако е така, повеќе би сакале да имаме релативно стабилна ефикасност на обратна транскрипција, што е она што сакаме да го видиме на сликата: 3 РНК добиваат 2 cDNA, 6 РНК добиваат 4 cDNA, така што без разлика колку примерок е вчитан, ефикасноста на обратна транскрипција е релативно стабилна.Не сакаме да ја видиме ситуацијата каде што ефикасноста на обратна транскрипција е нестабилна и високата концентрација е инхибирана.

Значи, како да се потврди дали ефикасноста на обратна транскрипција е стабилна?Методот е многу едноставен, потребно е само да направите споредбен тест: едната е да се врати транскрипција во cDNA по двојно разредување на РНК, а другата е да се направи двојно разредување по обратното транскрибирање во cDNA, а потоа да се направи qPCR за да се види добиениот наклон Дали е конзистентен.Како врвен студент, треба да го разберете за неколку секунди.Како што е прикажано подолу:

Разредување на РНК и cDNA за да се тестира дали ефикасноста на обратната транскрипција е стабилна
Обратна транскриптаза и комплет
Како може совршената флуоресцентна квантитативна PCR да има одлична реверзна транскриптаза и комплет.Реверзната транскриптаза е грубо поделена на два вида според изворот, АМВ илиM-MLV, а нивната изведба е иста како онаа прикажана во табелата.

Активност на RNase H
RNase H е рибонуклеаза H, кинеското име е рибонуклеаза H, која е ендорибонуклеаза која конкретно може да хидролизира РНК во хибридниот синџир ДНК-РНК.RNase H не може да ги хидролизира фосфодиестерските врски во едноверижна или двоверижна ДНК или РНК, односно не може да вари едноверижна или двоверижна ДНК или РНК.Најчесто се користи во синтезата на втората нишка на cDNA.

Тоа е чудна работа.Велиме дека реверзната транскриптаза има активност на RNase H, а не дека реверзната транскриптаза содржи RNase H и можеби не е можно да се оддели RNase H од реверзна транскриптаза, можеби поради конформацијата на одредени групи во реверзна транскриптаза Оваа активност е предизвикана од реверзната транскриптаза.

Затоа, без оглед на поголемата ефикасност на обратна транскрипција на AMV, неговата активност на RNase H го намалува приносот на cDNA.Се разбира, производителите на реагенси постојано ги оптимизираат своите производи за да ја елиминираат активноста на RNase H во реверзната транскриптаза колку што е можно повеќе за да го зголемат приносот на cDNA.
Температура на жарење

Секундарна структура на РНК на различни температури
Видете ја сликата погоре за секундарната структура на РНК на различни температури и користете ја онлајн алатката mFold за да ја одредите секундарната структура на целниот фрагмент под специфична температура и услови на концентрација на сол.На 55°C, секундарната структура на РНК е сè уште многу сложена, реверзната транскриптаза не може да работи, а секундарната структура не може целосно да се разреши до 65°C, додека оптималната температура на AMV и M-MLV е далеку пониска од оваа температура.
што да се прави?Секундарната структура е комплементарното спарување на самиот шаблон, што доведува до силна конкуренција помеѓу прајмерот и реверзната транскриптаза и шаблонот, што резултира со низа проблеми како ниска E и слаба повторливост.

што да се прави?Зголемете ја само температурата на жарење колку што е можно повеќе.

Многу производители на реагенси ја подобруваат нивната реверзна транскриптаза преку генетски инженеринг.Некои ја зголемуваат температурата на реакцијата, како Џифан и Аиделаи, а некои ја отстрануваат активната група на ензимот RNase H за да го подобрат афинитетот помеѓу ензимот и шаблонот РНК.Високиот афинитет може конкурентно да ја исцеди секундарната структура и непречено да ја чита, а исто така значително да ја подобри ефикасноста на обратната транскрипција.
Клучна точка: Обратна транскрипција е поважна за да се следи конзистентноста на ефикасноста на обратна транскрипција (ензимите не само што мора да бидат ефикасни, туку и стабилни), наместо количината на натоварениот примерок, ако не е особено голем флуоресцентен квантитативен PCR, тоа воопшто нема да биде можно.Повеќекратни cDNA.
Различни производители, исто така, направија одредени напори во потрагата по конзистентност.На пример, повеќето компании сега имаат спакувано обратна транскрипција како стандарден комплет за продажба, што е добар избор.
На пример, комплетите од серијата RT Easy на Foregene:

RT Easy I (Главниот премикс за комплет за синтеза на cDNA на првата жичка)

MIQE (5) – информации за целните гени

Горенаведената слика објаснува
1. Дали овој ген е ефикасен за повторени експерименти, генерално може да се потврди со повторени експерименти.
2. ИД на гени, знаеш.
3. Должината на генот, вкупната должина на целниот ген дефинитивно не е проблем.Кога дизајнирате прајмери, проверете дали должината на ампликонот е помеѓу 80-200 bp за да се обезбеди подобра ефикасност на засилување.
4. Информации за споредба на секвенца Blast, целниот ген треба да се спореди во генбанката за да се спречи неспецифично засилување.
5. Присуство на псевдогени.Псевдоген е ДНК секвенца слична на нормален ген, но ја губи својата нормална функција.Често постои во семејството на еукариоти со повеќе гени.Обично се претставува со ψ.Тоа е нефункционална геномска ДНК копија во геномот која е многу слична на генската секвенца за кодирање., генерално не се транскрибирани и немаат јасно физиолошко значење.
6. Положба на прајмери ​​во однос на егзоните и интроните.Во раните години, кога го решававме проблемот со контаминација на ДНК, често обрнувавме внимание на позициите на прајмерите, егзоните и интроните и генерално размислувавме да дизајнираме прајмери ​​низ интроните за да избегнеме засилување на ДНК.Ве молиме погледнете ја сликата подолу: црната боја ги претставува интроните, различните сини ги претставуваат егзони, розовата ги претставува обичните прајмери, а светло црвената ги претставува букварите кои опфаќаат интрони.

Шематски, никогаш не е точно
Каков совршен план изгледа ова, но всушност, во повеќето случаи, транс-интронските прајмери ​​не се толку магични како што се замислува, а исто така ќе предизвикаат неспецифично засилување.Така, најдобриот начин да се спречи контаминација на ДНК е целосно да се отстрани ДНК.
7. Предвидување на конформацијата.Користејќи го овој пример повторно, користете ја онлајн алатката mFold за да ја одредите секундарната структура на целниот фрагмент при одредена температура и концентрација на сол.

Секундарна структура на РНК на различни температури
Секундарната структура е комплементарното спарување на самиот шаблон, што ќе доведе до силна конкуренција помеѓу спарувањето на прајмерот и шаблонот, а шансите за врзување на прајмерот се помали, што резултира со низа проблеми како ниска Е и слаба повторливост.Преку софтверско предвидување, доколку нема проблем со секундарна структура, тоа би било одлично.Доколку постои, нашата дополнителна статија конкретно ќе разговара за тоа како да се реши овој проблем.

MIQE (6) - qPCR олигонуклеотиди

За флуоресцентна квантитативна PCR, првото нешто со кое се борите секој ден е екстракција на РНК, а втората работа може да биде дизајнот на прајмер.
Пред сè, ние сè уште ги проверуваме правилата за дизајнот на прајмерот според списокот за проверка на MIQE.Толку е едноставно што ѓубрињата можат да се смеат, а ние можеме да го завршиме со една реченица: дознајте ја низата и положбата на сондата за прајмер и методот на модификација.За методот на прочистување на прајмер, синтезата на прајмер е толку евтина во моментов, qPCR е достојна за методите за прочистување PAGE и над, а информациите за инструментот за синтеза не се важни.Многу луѓе прават прајмери ​​со децении и не знаат дека синтисајзерот е ABI3900.
Што се однесува до принципите на дизајнот на буквар, не мора да ги меморирате напамет, бидејќи повеќето софтвери за дизајн на прајмери ​​или онлајн алатки можат да се погрижат за овие проблеми (препорачана онлајн алатка primer3.ut.ee/), а 99,999% од дизајнот на прајмерот не се прави рачно Видете, авторот понекогаш дизајнира стотици буквари дневно, ако прочитате еден по еден.
Само проверете ги следните точки откако ќе се дизајнираат прајмерите:
1. Дизајн на прајмери ​​блиску до 3' крајот: Во случај на употреба на олиго dT прајмери ​​за синтеза на првата cDNA, имајќи ја предвид ефикасноста на обратна транскрипција и интегритетот на РНК, дизајнираните прајмери ​​треба да бидат дизајнирани блиску до 3' крајот за да се подобри ефикасноста на засилување.Користете слика за да објасните на следниов начин (нема начин да се разбере ова):

Зошто прајмерите да се дизајнираат блиску до 3' крајот, тоа не смее да биде точно
2. TM вредност: Вредноста на Tm е на 55-65°C (бидејќи активноста на егзонуклеазата е најголема на 60°C), а содржината на GC е на 40%-60%.
3. BLAST: За да се избегне неспецифично засилување на геномот, Blast мора да се користи за дополнителна верификација.

MIQE (7) - qPCR процес

1. комплет qPCR
Според барањата на MIQE, мора јасно да ги опишеме целосните услови за реакција во написот, вклучително и конфигурацијата на системот за реакција на PCR, каков комплет се користи, кој е производителот, колку е голем системот за реакција, дали се користи методот на боја или методот на сонда, поставките на програмата PCR.Возачите-ветерани дефинитивно ќе откријат дека се додека комплетот е избран, горенаведените информации во основа се одредуваат.
Во моментов, производството и производството на флуоресцентни квантитативни PCR комплети е многу зрела технологија.Сè додека не избирате исклучително лоши производители, веројатноста за проблеми не е голема, но сепак сакаме да споделиме со вас неколку точки:
Ензим Taq со топол почеток:Најважниот дел од PCR е ензимот Taq со топол почеток.Ензимите за топол старт на пазарот генерално се поделени на два вида, едниот е хемиски модифициран ензим за топол старт (можете да го замислите како вградување на парафин), а другиот е ензим за топол почеток за модификација на антитела (врзување антиген-антитело).Хемиската модификација е ран начин на ензими со жешко стартување.Кога ќе се достигне одредена температура, ензимот ќе ја ослободи својата активност.Ензимот за топол старт модифициран со антитела користи биолошки методи за да ја блокира активноста на ензимот.Кога ќе се постигне одредена температура, антителото ќе биде денатурирано и инактивирано како протеин, а ензимската активност ќе биде вклучена во игра.

Меѓутоа, каква е користа од ова?Ова е случај, активноста на ослободување на ензимите модифицирани со антитела е побрза од онаа на хемиски модифицираните ензими, така што во однос на чувствителноста, ензимите модифицирани со антитела имаат мала предност, така што во основа нема хемиски модифицирани ензими во комплетите на пазарот.Ако постои, тогаш технологијата на овој производител сè уште е заглавена во ерата на милениумот.
Концентрација на магнезиум јони:Концентрацијата на јони на магнезиум е многу важна во PCR реакцијата.Соодветната концентрација на јони на магнезиум може да го промовира ослободувањето на активноста на ензимот Taq.Ако концентрацијата е премногу ниска, ензимската активност ќе биде значително намалена;ако концентрацијата е превисока, ензимската неспецифична засилување ќе биде засилена.Концентрацијата на јони на магнезиум, исто така, ќе влијае на жарењето на прајмерите, температурата на топење на шаблонот и производите на PCR, а со тоа ќе влијае на приносот на засилените фрагменти.Концентрацијата на јони на магнезиум генерално се контролира на 25 mM.Се разбира, за добар комплет, концентрацијата на јони на магнезиум мора добро да се контролира.Некои трговци додаваат средство за хелање на магнезиум јони во реагенсот, што може да постигне ефект на автоматско прилагодување на концентрацијата на магнезиум јони.
Концентрација на флуоресцентна боја:Fluorescent dye, which is the SYBR Green we usually use, mainly generates fluorescence by binding to the minor groove of double-stranded DNA, because the binding of the dye to double-stranded DNA is non-specific, that is to say As long as double-stranded DNA is combined with it, fluorescence can occur, so primer-dimers and DNA templates in the system will combine with it to form a background signal.
PS: Поради неговите особини осетливи на светлина, производите на пазарот генерално се спакувани во кафени непроѕирни цевки за центрифугирање (како што е прикажано на сликата подолу).Сепак, ова ќе наиде на проблем.Тешко е да се види дали течноста се вшмукува при земање мостри.Во овој поглед, Qingke е навистина најпријателски за користење (како што е прикажано на сликата подолу), а проѕирната цевка е спакувана во непроѕирна лимена кеса.Потоа ставете го во лимена кеса, земајќи ја предвид практичноста за избегнување светлина и земање примероци.Мора да го изберете вистинскиот број на производот.TSE204 е супер исплатливо постоење, што ме тера да сакам да засадувам трева.

Концентрацијата на флуоресцентната боја е исто така многу важна.Ако концентрацијата е премногу ниска, кривата на засилување нема да се зголеми во подоцнежната фаза и не е совршена;ако концентрацијата е превисока, тоа ќе предизвика пречки на бучавата.Бидејќи флуоресцентната квантитативна PCR главно зависи од вредноста на КТ, ако концентрацијата на флуоресцентната боја не е правилно прилагодена, ниската точка е подобра од високата точка.Се разбира, соодветната концентрација на боја е најдобра.

РОКС: ROX боите се користат за да се поправат грешките на флуоресцентните сигнали добро до бунар.Некои производители на инструменти бараат калибрација, додека други не.На пример, употребата на инструментот за засилување на PCR во реално време на Thermo Fisher Scientific обично бара калибрација, вклучувајќи 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus итн. Упатствата за општиот комплет ќе го опишат тоа.
QPCR Mix на Foregene содржи и ROX боја, која е погодна за употреба во различни модели.

Комплет PCR-Taqman во реално време

Третман на слаби водородни врски: Третманот на слабите водородни врски е релативно техничка работа.Ништо не ги прочитало прирачниците на многу комплети, но ниту еден од нив не ја спомнал оваа тема.Всушност, тоа е толку важно.Комбинацијата на бази главно зависи од јачината на водородните врски.Силните водородни врски се нормално засилување, а слабите водородни врски доведуваат до неспецифично засилување.Ако слабите водородни врски не можат добро да се елиминираат, не може да се избегне неспецифично засилување.Во опсегот на авторот, само неколку компании го забележале овој проблем.Кога ќе го купите комплетот, можете да се повикате на тоа дали сте размислувале за решение во овој поглед за комплетот што сакате да го изберете.

Волумен на реакција: Почесто се користи системот 20-50ul, а помалите волумени веројатно ќе предизвикаат грешки.Општо земено, упатствата на комплетот ќе препорачаат употреба на волумени на PCR реакција.Не бидете паметни и користете помали количини за да заштедите трошоци.целта на.Волуменот препорачан од трговците всушност е тестиран и можеби тие не можат да го решат проблемот со грешките предизвикани од мали количини.
2. Производителот и бројот на производот на плочата на цевката
Секој го знае принципот на флуоресцентна квантитативна PCR.Собирањето на флуоресценција главно се врши преку капачиња од PCR цевки.При изборот на потрошен материјал за PCR, обрнете внимание на две точки: добар пренос на светлина и погоден за инструментот.Општо земено, таблите и цевките на мејнстрим брендовите се во ред, но треба внимателно да изберете во однос на адаптацијата, инаку нема да можете да го користите инструментот.

4. Знаење од највисоко ниво

MIQE (8) - qPCR валидација
Ова е врвен приоритет на qPCR!Толку многу херои паднаа во песок овде.Секако, можно е и да имате среќа, а гените кои сте ги проучувале да се едноставни, па сте лебдела низ ледената пештера покрај ветрот.Информациите за верификација на qPCR се наменети за тестирање на веродостојноста на податоците.Ги наведуваме потребните информации за верификација како што следува:

1.Тест за специфичност
Специфичноста на засилувањето на целниот ген се тестира со проверка дали сликата на електрофорезата е една лента;верификација на секвенционирање;крива на топење за да се види дали мапата на врвот е единечна;верификација на дигестија на ензими и други методи.
Овде, се фокусираме на ттој анализа на неспецифично засилување со помош на методот на криви на топење.Општо земено, кога дизајнираме прајмери, големината на фрагментот на производот се бара да биде во опсег од 80-200bp, што ја прави температурата на топење на производот PCR од 80-85 °C.Затоа, ако има различни врвови, мора да има и други неспецифични производи за засилување;ако врвот се појави под 80°C, генерално се смета дека е димер за прајмер;ако врвот се појави над 85°C, генерално се смета дека е контаминација на ДНК или повеќе неспецифично засилување на големи фрагменти.
Забелешка: Понекогаш има само еден врв на 80°C.Во овој момент, овој концепт мора да се почитува.Многу е веројатно дека резултатите од засилувањето се сите прајмерни димери.

Нормална крива на топење (еден врв без неспецифично засилување)

Проблематична крива на топење (неспецифично засилување на лажни врвови)
【Анализа на случај】

Постои главен врв, но димерот на прајмерот е сериозен
Кривата на топење со еден врв на сликата подолу може лесно да ги измами вашите очи, мислејќи дека е совршен експеримент, но резултатот е сосема погрешен.Во тоа време, треба да ја разгледаме температурата на топење.Максималната температура е под 80°C, што е целосно прајмер-димер.

Нема целен фрагмент, сите прајмерни димери
Еве, брат ми не може да запре.Сликата подолу е фотографија направена со мобилен телефон што ми ја испрати ѓубре.Реагенсите што ги користел се сите најчесто користени марки во индустријата.Тој се смени од еден бренд на Т-префикс во друг бренд на Т-префикс.Мислам дека веќе погодивте.Гомнарот ми завика: „Реагенсот што се користеше на првата слика е премногу добар, а врвот е сингл.Подоцна, по користење на реагенсот што го препорачавте, станува како на втората слика, со измешани врвови.Ме направи беден.“
Одделете ги двата графикони.На прв поглед, едниот има единечен врв, а другиот има двоен врв.Глупости, еден врв е секако во ред.Дали е тоа вистина?
Полошо од Dou E, ако ги ставам двете слики на сликата подолу, веднаш ќе разберете.Всушност, лесно се парализираме од ваквата слика.По внимателна анализа, откривме дека: врвот на првата бројка е на 75°C, што е целосно прајмер димер;врвот на втората бројка се појавува на 75°C и 82°C, барем има Производот се појавува.

Слики од повратни информации од учениците
Значи, основниот проблем не е проблемот со реагенсите, туку проблемот со дизајнот на прајмерот.Во исто време, тоа исто така докажува дека некои големи брендови не се со квалитет на железо, а исто така го докажува и она што брат ми претходно го кажа: Не е брендот на реагенсот што ја поддржува вашата статија.Тоа е вашата статија што го поддржа брендот на реагенси.Замислете, ако гомнарот не ги смени реагенсите, погрешните податоци ќе бидат испратени во дневникот, а она што ќе се случи ќе биде трагедија.
2. Ct вредност на бланко контрола
Не објаснувај, ако бланко-контролата има Ct вредност, нели е загадување?Сепак, сепак треба да разберете која празна контрола има вредност Ct.Ако е NTC, тоа значи дека има туѓа ДНК како што е контаминација со реагенс.Ако е NRT, тоа значи дека извлечената РНК има контаминација на ДНК.
3. Стандардна крива
Вклучувајќи ја формулата за наклон и пресметка, ефикасноста на PCR може да се пресмета преку формулата.Совршен експеримент бара наклонот на стандардната крива да се приближи до 3,32, а R² да се приближи до 0,9999.
4. Линеарен динамички опсег
Динамичкиот опсег на реакцијата е линеарен.Според шаблонот што се користи за генерирање на стандардната крива, динамичкиот опсег треба да вклучува најмалку 5 градиенти на концентрации и да се внимава на промената на вредностите на Ct при градиенти со високи концентрации и градиенти со ниска концентрација.
5. Точност на откривање
Промените во резултатите од qPCR, односно слабата повторливост, односно слабата прецизност, се предизвикани од многу фактори, вклучувајќи температура, концентрација и работа.qPCR прецизноста генерално станува помалку контролирана како што бројот на копии се намалува.Идеално во рамките на експерименталната варијација, оваа техничка варијација треба да се разликува од биолошката варијација, а биолошките реплики можат директно да ги адресираат статистичките разлики во резултатите од qPCR помеѓу групите или третманите.Особено за дијагностички анализи, мора да се пријави најдобрата прецизност меѓу анализите (повторливост) меѓу локациите и операторите.
6. Ефикасност на откривање и LOD (во мултиплекс qPCR)
LOD е најниската концентрација од 95% од откриените позитивни примероци.Со други зборови, концентрацијата на LOD содржана во збир на реплики на целните гени не треба да надминува 5% од неуспешните реакции.Кога се прави мултиплекс qPCR анализа, особено за истовремена детекција на точкести мутации или полиморфизми, мултиплекс qPCR треба да обезбеди докази дека точноста на повеќе целни фрагменти не е загрозена во иста цевка, повеќекратно откривање и детекција на една цевка Ефикасноста и LOD треба да бидат исти.Особено кога целните гени со висока концентрација и целните гени со ниска концентрација се истовремено засилени, на овој проблем мора да се обрне внимание.
Проблеми и решенијаОпшто земено, проблемите што често се среќаваат при дебагирање на qPCR се фокусираат на следниве аспекти:
·неспецифично засилување
· Тежок избор на концентрација на прајмер и проблеми со прајмер-димери
· Температурата на жарење е неточна
·Секундарната структура влијае на ефикасноста на засилувањето
неспецифично засилување
неспецифично засилувањесе случува , генерално се смета дали дизајнот на прајмерот не е соодветен, но ако не брзате да ги промените прајмерите, можете прво да ги испробате следните методи (принципот е исто така прикачен):
·Зголемете ја температурата на жарење – обидете се да создадете слаби водородни врски кои не можат да се одржат;
·Скратете го времето на жарење и издолжување – ја намалува можноста за слаби водородни врски;
·Намалете ја концентрацијата на прајмерот – намалете ја можноста за врзување на вишокот прајмери ​​и нецелните региони;
Ниска ефикасност на засилување
Спротивната ситуација на неспецифичното засилување - ниска ефикасност на засилување и мерките за справување со ниската ефикасност на засилување се токму спротивното:
·Продолжете го времето на жарење и издолжување;
·Промени во тристепена PCR и намалете ја температурата на жарење;
·Зголемете ја концентрацијата на прајмерот;
Ps: Многу дипломирани студенти родени во 90-тите не се подготвени да учат како да дебагираат експерименти и се надеваат дека комплетот може целосно да го реши проблемот (ако сакате да отидете во компанија за реагенси за да направите истражување и развој по дипломирањето), всушност, производителите на реагенси исто така размислуваат на овој начин, се надевам дека е будала. слаби фактори на апсорпција на H-врска.За полесно да го решат проблемот, будалите сè уште треба да го прочитаат воведот на компанијата за реагенси за да видат дали постои фактор што апсорбира слаби водородни врски.
Тежок избор на концентрација на прајмер и проблеми со прајмер-димери
Метод 1: Општо земено, упатствата на комплетот за qPCR имаат препорачани системи и препорачани концентрации на прајмер.
Метод 2: Дебагирање со поставување на градиентот на концентрацијата на прајмерот.Сликата подолу е украдена од една компанија за илустрација.Сликата подолу ги прикажува квантитативните резултати на флуоресценција направени со три градиенти на концентрации на прајмер (100nM, 250nM, 500nM) и четири градиенти на концентрација на шаблонот (0,1ng, 1ng, 10ng, 100ng).Вредноста Ct на експерименталните резултати е прикажана на следниов начин:

Избор на концентрација на прајмер Спојте ја секоја концентрација на прајмер во линија на следниов начин:

Изборот на концентрацијата на прајмерот е очигледен, линеарната врска на концентрацијата на прајмерот од 100nM и 250nM е подобра, а линеарната врска на концентрацијата на прајмерот од 500nM е релативно лоша.Во 100nM и 250nM, вредноста на Ct од 250nM е релативно мала, така што оптималната концентрација на прајмер е 250nM.Генерално тешки прајмер-димери може да се видат во кривата на топење.Што ако дизајнираните прајмери ​​не можат да ги избегнат прајмер-димерите?
Метод 3: Намалете ја количината на прајмери ​​и зголемете ја температурата на жарење (нема потреба да објаснувате).
Емпириската вредност на температурата на жарење е 60°C.Ако не сте сигурни, како да изберете посоодветна температура за жарење?Одговорот е ист како и изборот на концентрација на прајмер -градиент тест.Направете слика од компанијата Bio-rad за да го илустрирате проблемот.За засилување на одреден целен фрагмент, поставете осум температурни градиенти, секој со три повторувања, а добиената крива на засилување е како што следува:

Избор на температура на жарење:
·70°C, 69°C — Во основа, прајмерите не можат да се комбинираат, така што нема засилување.
·67,3°C – Има мала количина на засилување на почетокот, а вредноста на Ct е релативно голема.
·64,5°C——Вредноста Ct се намалува.
·На 60,7°C, 58,0°C, 56,2°C и 55,0°C, вредностите на Ct во основа имаа тенденција да бидат стабилни, но конечните вредности на флуоресценција беа различни.
Како да се избере?Принцип: Првиот принцип е повисоката Ct вредност.За истата вредност Ct, изберете повисока температура на жарење за да избегнете димеризација и неспецифично засилување.Иако има повисока флуоресцентна вредност на 55°C, во него може да има димери или неспецифично засилување.
Но, ако сте паметни како вас, дефинитивно ќе помислите: Логично гледано, ако PCR реакцијата е многу специфична, се додека концентрацијата на прајмерот го надминува минималното барање, високите и ниските точки не треба да имаат ефект, исто како флуоресцентните бои и dNTP.Навистина, се додека температурата на жарење е оптимизирана правилно, ефектот на концентрацијата на прајмерот врз вредноста на Ct природно ќе се минимизира.

Температурата на жарење е оптимизирана правилно, а ефектот на концентрацијата на прајмерот на КТ ќе се минимизира
Секундарната структура влијае на ефикасноста на засилувањето
Ајде да ја земеме сликата од Bio-rad за да го илустрираме проблемот.Исто така, дизајнира температурен градиент за засилување на генот со секундарна структура.

Се појавува секундарна структура
Може да се види дека како што се намалува температурниот градиент, производите почнуваат да се појавуваат и вредноста Ct се движи напред, достигнувајќи ја минималната вредност на 60,7°C, а потоа како што температурниот градиент се намалува, вредноста на Ct станува поголема.Спротивно на тоа, како што температурата се зголемува, секундарната структура се отвора и се зголемува ефикасноста на засилување.По постигнување одредена температура, зголемувањето на температурата не може да ја подобри ефикасноста на засилување.Бидејќи прајмерите не можат стабилно да се комбинираат во овој момент.Затоа,побарајте ја температурата со најниска Ct вредност, која е најдобрата температура за засилување на шаблонот за секундарна структура!Се разбира, паметните будали мора да знаат дека ако тоа не е потребно, најдобро е да се сменат прајмерите и да се избегне регионот на секундарната структура.
5. Ниво на апликација
MIQE - Анализа на податоци

Анализата на податоците главно се дава со флуоресцентниот квантитативен PCR инструмент.Во претходната статија, направена е многу работа за анализа на податоци, како што е празната контрола, која е објаснета во дизајнот на експериментот.Разјаснети се внатрешните референтни гени, повторените броеви итн., овде главно ја објаснуваме примената на qPCR.
qPCR е широко користен, а експерименталната верификација и дијагнозата на нуклеинска киселина се најчесто користените сценарија.
апсолутна квантификација
Лог (почетна концентрација) има линеарна врска со бројот на циклуси.Стандардна крива може да се извлече од стандард со познат почетен број на копија, односно може да се добие линеарна врска на реакцијата на засилување.Според вредноста на Ct на примерокот, може да се пресмета концентрацијата во мострата.Количината на шаблони што треба да се вклучат.

Апсолутен квантитативен метод на пресметување
Апсолутна квантификација мора да се заснова на стандардната крива.За да се направи стандардна крива, потребен е стандард.Вообичаено, стандардот е плазмид добиен со клонирање на целниот ген.Зошто е плазмид?Бидејќи кружната плазмидна ДНК е најстабилна.Разредете го стандардниот производ во 5 до 6 градиенти според односот на удвојување (разредување 10 пати) и внимавајте на униформноста при разредувањето.Нека вредноста Ct падне помеѓу 15-30.

Стандардна подготовка
Во исто време, примерокот што треба да се тестира треба соодветно да се разреди (запомнете го факторот на разредување), а вредноста на Ct исто така треба да падне помеѓу 15-30.Стандардниот производ + примерокот што треба да се тестира се ставаат на машината заедно.По испуштањето, беше направена стандардна крива со стандардната супстанција, а примероците што требаше да се тестираат беа внесени во стандардната крива за да се пресмета концентрацијата.
Квантификацијата на ХБВ вирусот на хепатитис Б е типична апсолутна квантификација, која може да го пресмета бројот на копијата на вирусот во 1 ml крв.
Пресметка на бројот на копијата
Концентрација на примерокот што треба да се тестира (ng/ul) = OD260 × 50 ug/ml × фактор на разредување
Молекуларна тежина на примерокот = број на бази × 324
Бројот на копијата на примерокот што треба да се тестира (копии/ул) = концентрацијата на примерокот што треба да се тестира / молекуларната тежина на примерокот × 6 × 1014

Начин на пресметка на бројот на копијата

Горенаведеното е пресметковен метод за одредување на количината.Ова е математички проблем што може да се реши по завршувањето на средното училиште, а математичките проблеми генерално се решаваат со компјутери.Ако не разбирате, можете да дојдете да комуницирате.
релативна квантификација
Релативната квантификација главно се користи во научните истражувања.Колку вируси има во 1 ml крв, а тоа е ДНК вирус, ова е релативно детерминистички настан: може да се одреди количината на крв, а ДНК вирусот е релативно стабилен.Сепак, тешко ни е да го споредиме бројот на копии на транскрипција на одреден ген во листот, бидејќи е тешко да се одреди големината, тежината и нежноста на листот, количината на извлечена РНК е тешко да се одреди, а ефикасноста на обратната транскрипција е исто така тешко да се одреди, односно, каков било чекор може да предизвика грешки и експериментални податоци да се користат.
Затоа, релативната квантификација мора да воведе елемент:внатрешниот референтен ген.
Со други зборови, релативната квантификација е всушност споредба помеѓу целниот ген и внатрешниот референтен ген.Споредено во исто ткиво и иста клетка, влијанието на големината на примерокот, количината на екстракција на РНК, ефикасноста на обратна транскрипција и ефикасноста на PCR е релативно мало.Поради малата големина на примерокот, и внатрешните референтни гени и целните гени беа релативно намалени.Затоа и претходно ја нагласувавме униформноста и стабилноста.
Внатрешните референтни гени се генералногени за домаќинство( гени за одржување на куќата), кои се однесуваат на класа на гени кои се стабилно изразени во сите клетки, а нивните производи се неопходни за одржување на основните животни активности на клетките.
Не мешајте го овој концепт.Домаќинските гени се термини за биолошка функција, додека внатрешните референтни гени се експериментални технички термини.Домаќинските гени треба да поминат валидација пред да бидат избрани како внатрешни референтни гени.
На пример, избравме неколку домашни гени на сликата подолу за да ги тестираме нивните нивоа на изразување во различни ткивни клетки и откривме дека нивоата на изразување на β-2-микроглобулинот се сосема различни од оние на другите три гени, така што тие не може да се користат како внатрешни референтни гени.

По разбирањето на функцијата за корекција на внатрешниот референтен ген, изведени се два алгоритми поради воведувањето на внатрешниот референтен ген.
· метод со двојна стандардна крива
·2 – △△Ct метод (метод за споредба на вредности на КТ)
Ако сте заинтересирани за проучување на видовите и функциите на гените, ве молиме откажете се од истражувањето за алгоритми и директно користете формули или директно користете машини;ако сте стрејт тип по математика и инженерство, ве молиме слободно.
метод на крива со двоен стандард
Измерете го целниот ген и генот за домаќинство на контролниот примерок и примерокот што треба да се тестира преку стандардната крива, а потоа пресметајте ја релативната вредност според формулата за пресметка, што е релативно ниво на изразување.
Предности: едноставна анализа, релативно едноставна експериментална оптимизација
Недостаток: за секој ген, секој круг на експерименти мора да направи стандардна крива
Примена: Еден од двата најчесто користени и признати релативни квантитативни методи во проучувањето на регулацијата на генската експресија
Формулата е како што следува:

Примерите се како што следува:

Пресметајте го релативниот износ врз основа на квантитативниот резултат
2 – △△Ct метод (метод за споредба на вредности на КТ)

Предности: Нема потреба да се прави стандардна крива
Недостатоци: Се претпоставува дека ефикасноста на засилување е блиску до 100%;стандардното отстапување е < 5%, а стандардната крива и ефикасноста помеѓу секое засилување се претпоставува дека се конзистентни;оптимизацијата на експерименталните услови е посложена.
Примена: Еден од двата најчесто користени и признати релативни квантитативни методи во проучувањето на регулацијата на генската експресија

Се разбира, ефикасноста на засилување обично е невозможно да биде совршено 1. Метод на корекција: Ако знаеме дека целниот ген и референтниот ген имаат иста ефикасност на засилување, но ефикасноста на засилување не е еднаква на 1, тогаш 2-△△Ct може да се коригира како: , тогаш формулата за пресметка може да се коригира на 1,95-△△Ct
Досега, содржината за флуоресцентна квантитативна PCR е завршена.