Колоната се приклучи

Откако ќе се затне колоната, приносот на РНК е намален или дури и невозможно да се прочисти РНК, а добиената РНК маса е мала.

Анализа на вообичаени причини:

1. Паузите за примероци не се темелни.

Кршењето на примерокот не предизвикува целосно блокирање на КОЛОНАТА ЗА ЧИСТЕЊЕ ДНК, додека влијае на приносот и квалитетот на РНК.Препорачуваме брза операција на мелење во доволно течен азот кога ќе ги скршите примероците. Обидете се да го скршите клеточниот ѕид на примерокот, клеточната мембрана и другото ткиво.За растителни примероци на полиол полисахариди, ви препорачуваме да користите КОМПЛЕТ ЗА ИЗОЛАЦИЈА НА РНК на растенијата ПЛУС.

2. При вшмукување на супернатантот од одвоениот примерок со колона за чистење на ДНК, можниот талог од фрагментација на клетките може да се вдишува.

Земените фрагментирани седименти на клетките ќе предизвикаат колона САМО РНК која ќе биде блокирана кога ќе се изврши операцијата за адсорпција на РНК (видете го чекор 6).Ви препорачуваме внимателно да го вшмукувате овој супернатант за да избегнете вшмукување на клеточни остатоци.

3. Почетниот износ на примерокот е премногу.

Прекумерното користење на примерокот ќе резултира со нецелосна фрагментација на примерокот или нецелосна клеточна лиза со пуфер PSL1, што ќе резултира со блокирање на колоната за прочистување за време на прочистувањето.Комплет за изолација на тотална РНК на растенијата Секој прочистен оперативен примерок е 50 mg.За растителни примероци на полиол полисахариди, ви препорачуваме да го пробате КОМПЛЕТ ЗА ИЗОЛАЦИЈА НА РНК на растенијата ПЛУС.

4. Температурата на центрифугата е премногу ниска.

Целиот процес на изолација и прочистување на РНК се изведува на собна температура (20-25°В), освен што ткивото на примерокот е скршено со течен азот. Температурата на некои криогени центрифуги е пониска од 20℃, што може да предизвика блокирање на колоната за чистење на ДНК и/или колоната само за РНК.Ако тоа се случи, поставете ја температурата на центрифугата на 20-25℃, ипроверете дали смесата за лиза и/или супернатантот додаден со етанол се претходно загреани на 37°C.

Не се екстрахира РНК или приносот на РНК е низок

Обично има многу фактори кои влијаат на ефикасноста на обновувањето, како што се: содржината на РНК на примерокот, методот на работа, волуменот на елуцијата итн.

Анализа на вообичаени причини како што следува:

1. За време на операцијата беше извршена ледена бања или центрифугирање на ниска температура (4°C).

Предлог: Работете на собна температура (15-25°В) во целиот процес, не правете ледена бања и центрифугирање на ниска температура.

2. РНК е деградирана поради неправилно зачувување на примерокот или долгорочно зачувување на примерокот.

Препорака: Свежо собраните примероци треба брзо да се замрзнат во течен азот, а потоа да се чуваат на -80°C долго време, да се избегнува повторното замрзнување и одмрзнување на примероците;или веднаш натопете ги примероците во РНК стабилизатор RNA полатер раствор (примероци од животни).

3. Недоволната фрагментација и лиза на примерокот доведува до блокирање на колоната за прочистување.

Предлог: Кога го мелете ткивото, проверете дали ткивото е доволно сомелено и брзо префрлете го во претходно подготвениот пуфер PSL1 (потврдете дека е додаден правилниот дел од β-ME, видете го чекор 1 од постапката).

4. Елуентот е погрешно додаден.

Предлог: Проверете дали ddH2O без RNase се капе во средината на мембраната на колоната за прочистување.

5. Точниот волумен на апсолутен етанол не беше додаден во пуфер PSL2 или пуфер PRW2.

Предлог: Ве молиме следете ги упатствата, додајте го точниот волумен на апсолутен етанол во Buffer PSL2 и Buffer PRW2 и добро измешајте пред да се користи комплетот.

6. Количината на примерок од ткиво е несоодветна.

Предлог: Користете 50 mg ткиво на 500 μl пуфер PSL1.Користењето на премногу ткиво ќе ја намали количината на извлечена РНК и ќе се намали и чистотата на добиената РНК.Силно препорачуваме почетната доза на примерок да не надминува 50 mg по операција за екстракција на РНК.

7.Несоодветен волумен на елуирање или нецелосно елуирање.

Предлог: Волуменот на елуентот на колоната за прочистување е 50-200 μl;ако ефектот на елуција не е задоволителен, се препорачува да се продолжи времето на собна температура по додавање на претходно загреан ddH2O без RNase, како на пример 5-10 мин.

8. Колоната за прочистување има остатоци од етанол по миењето со BufferPRW2.

Предлог: Ако празната епрувета се центрифугира 1 мин и останува уште етанол по миењето во пуфер PRW2, можете да го зголемите времето на центрифугирање на празната цевка на 2 минути или да ја ставите колоната за прочистување на собна температура 5 минути за целосно да го отстраните преостанатиот етанол.

9. Комплетот е користен погрешно.

Предлог: За растителни примероци на полифенолни полисахариди, со користење на вообичаени комплети како што е комплетот за изолација на тотална РНК на растенијата можеби нема да може да се добијат идеални примероци на РНК.Ви препорачуваме да го користите Plant Total RNA IsolationKit Plus, кој е специјално дизајниран за примероци од растителни полифенолни полисахариди.Комплет специјално развиен за екстракција на РНК од растителни примероци од полифенол и полисахариди.

Вредноста на OD260/OD280 е ниска

Елуцијата на РНК со ddH2O и употребена за отчитување на спектрофотометарот резултира со ниски вредности на OD260/OD280.Препорачуваме користење на 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 (наместо ddH2O без RNase за елуирање на РНК) за да се добијат релативно точни вредности на OD260/OD280, видете во „Асеси за концентрација и прочистување на РНК“ на страница 19.

Прочистената РНК се разградува

Квалитетот на прочистената РНК е поврзан со фактори како што се зачувување на примерокот, контаминација со RNase и манипулација.

Анализа на вообичаени причини:

1. Примероците од ткивото не беа складирани навреме по собирањето.

Препорака: Ако примероците од ткивото не се искористат навреме по собирањето, ве молиме чувајте ги во течен азот на ниска температура веднаш или префрлете ги на -80°C за долгорочно складирање по брзо замрзнување во течен азот, или веднаш потопете ги примероците во раствор од РНК стабилизатор RNA полатер (животински примероци ).За екстракција на РНК, обидете се да користите свежо собрани примероци од ткиво.

2.Повторено замрзнување и одмрзнување на примероци од ткиво.

Предлог: При складирање на примероци од ткиво, најдобро е да се исечат на мали парчиња за конзервирање, а дел од нив да се извади кога се користат за да се избегне разградување на РНК предизвикано од повеќекратно замрзнување и одмрзнување на примероците.

3.RNase се внесува во операционата сала или не се носат ракавици за еднократна употреба, маски итн.

Предлог: Експериментите за екстракција на РНК најдобро се изведуваат во посебни операции со РНК, а лабораториската маса треба да се исчисти пред експериментот, а за време на експериментот треба да се носат ракавици и маски за еднократна употреба за да се избегне деградација на РНК предизвикана од воведувањето на РНаза во најголема мера.

4. Реагенсот е контаминиран со RNase за време на употребата.

Предлог: Заменете со нова серија комплети за екстракција на вкупна РНК на растенијата за поврзани експерименти.

5. Цевките за центрифугирање и врвовите на пипетите што се користат за манипулација со РНК се контаминирани со RNase.

Предлог: Осигурете се дека цевките за центрифуга, врвовите на пипетите, пипетите итн. што се користат при екстракција на РНК се без RNase.

Упатства за употреба:

Прирачник за употреба на Plant Total RNA Isolation Kit Plus