Објаснување на основните поими од молекуларната биологија
1. cDNA и cccDNA: cDNA е двоверижна ДНК синтетизирана со реверзна транскриптаза од mRNA;cccDNA е плазмидна двоверижна затворена кружна ДНК ослободена од хромозомот.
2. Стандардна единица за преклопување: протеинската секундарна структурна единица α-спирала и β-лист може да формираат структурни блокови со посебни геометриски распореди преку различни поврзувачки полипептиди.Овој тип на определено превиткување обично се нарекува супер секундарна структура.Скоро сите терциерни структури може да се опишат со овие типови на преклопување, па дури и нивните комбинирани типови, па затоа се нарекуваат и стандардни преклопни единици.
3. CAP: цикличен аденозин монофосфат (cAMP) рецепторен протеин CRP (cAMP рецепторен протеин), комплексот формиран по комбинацијата на cAMP и CRP се нарекува активирачки протеин CAP (cAMP активиран протеин)
4. Палиндромска секвенца: обратна комплементарна низа на сегмент од фрагмент на ДНК, често место на рестриктивен ензим.
5. micRNA: Комплементарна интерферирачка РНК или антисензисна РНК, која е комплементарна со секвенцата на мРНК и може да го инхибира транслацијата на мРНК.
6. Рибозим: РНК со каталитичка активност, која игра автокаталитичка улога во процесот на спојување на РНК.
7. Мотив: Постојат некои локални региони со слична тридимензионална форма и топологија во просторната структура на протеинските молекули
8. Сигнален пептид: пептид со 15-36 остатоци од аминокиселини на N-крајот за време на синтезата на протеините, кој ја води трансмембраната на протеинот.
9. Атенуатор: нуклеотидна секвенца помеѓу операционата област и структурниот ген што ја прекинува транскрипцијата.
10. Волшебна точка: Кога бактеријата ќе порасне и ќе наиде на целосен недостаток на аминокиселини, бактериите ќе произведат итен одговор за да го запрат изразувањето на сите гени.Сигналите кои го генерираат овој одговор за итни случаи се гванозин тетрафосфат (ppGpp) и гванозин пентафосфат (pppGpp).Улогата на PpGpp и pppGpp не е само еден или неколку оперони, туку влијае на голем број од нив, па затоа се нарекуваат супер-регулатори или магични точки.
11. Возводно промоторски елемент: се однесува на секвенцата на ДНК која игра регулаторна улога во активноста на промоторот, како што е TATA во -10 регионот, TGACA во -35 регионот, засилувачи и атенуатори.
12. ДНК сонда: означен сегмент на ДНК со позната секвенца, која е широко користена за откривање непознати секвенци и скрининг целни гени.
13. SD секвенца: Тоа е врзувачката низа на рибозомот и mRNA, која го регулира транслацијата.
14. Моноклонални антитела: антитело што делува само против една антигенска детерминанта.
15. Космид: Тоа е вештачки конструиран егзоген ДНК вектор кој ги задржува COS регионите на двата краја на фагот и е поврзан со плазмидот.
16. Скрининг на сино-бели дамки: LacZ ген (кодирајќи β-галактозидаза), ензимот може да го разложи хромогениот супстрат X-gal (5-бромо-4-хлоро-3-индол-β-D-галактозид) за да произведе сина боја, со што сојот ќе стане син.Кога ќе се вметне егзогената ДНК, генот LacZ не може да се изрази, а сојот е бел, за да се скринираат рекомбинантните бактерии.Ова се нарекува сино-бел скрининг.
17. Цис-делувачки елемент: Специфична низа на бази во ДНК што ја регулира генската експресија.
18. Klenow ензим: Голем фрагмент од ДНК полимераза I, освен што активноста на 5'3' егзонуклеаза е отстранета од холоензимот ДНК полимераза I
19. Закотвен PCR: се користи за засилување на ДНК од интерес со позната секвенца на едниот крај.На едниот крај од непознатата низа беше додадена опашка од поли-dG, а потоа поли-dC и познатата низа беа користени како прајмери за PCR засилување.
20. Фузионен протеин: генот на еукариотскиот протеин е поврзан со егзоген ген, а протеинот составен од транслација на оригиналниот генски протеин и егзогениот протеин се изразува во исто време.
Други термини за молекуларна биологија
1. Физичката карта на ДНК е редоследот по кој се распоредени фрагментите од молекулата на ДНК (дигестирани со рестриктивна ендонуклеаза).
2. Расцепувањето на RNase е поделено на два вида (автокатализа) и (хетерокатализа).
3. Постојат три фактори на иницијација кај прокариотите се (IF-1), (IF-2) и (IF-3).
4. Трансмембранските протеини бараат насоки (сигнални пептиди), а улогата на протеинските чаперони е (помага да се преклопи пептидниот синџир во природната конформација на протеинот).
5. Елементите во промоторите генерално може да се поделат на два вида: (основни промоторни елементи) и (промоторни елементи нагоре).
6. Истражувачката содржина на молекуларната биологија главно вклучува три дела: (структурна молекуларна биологија), (генска експресија и регулација) и (технологија на рекомбинација на ДНК).
7. Двата клучни експерименти кои покажуваат дека ДНК е генетскиот материјал се (пневмококна инфекција кај глувци) и (Т2 фаг инфекција на Escherichia coli).потенцијал).
8. Постојат две главни разлики помеѓу hnRNA и mRNA: (hnRNA се спојува во процесот на претворање во mRNA), (5' крајот на mRNA се додава со капаче m7pGppp и има дополнителна полиаденилација на 3' крајот на опашката на mRNA киселина (polyA).
9. Предностите на формата на протеини со повеќе подединици се (подединица е економичен метод за искористување на ДНК), (може да го намали влијанието на случајните грешки во синтезата на протеини врз активноста на протеините), (активноста може да биде многу ефикасно и брзо се отвора и затвора).
10. Главната содржина на протеинскиот механизам за преклопување на првата теорија на нуклеација вклучува (нуклеација), (структурно збогатување), (конечно преуредување).
11. Галактозата има двоен ефект врз бактериите;од една страна (може да се користи како извор на јаглерод за раст на клетките);од друга страна (исто така е компонента на клеточниот ѕид).Затоа, независен од cAMP-CRP промотер S2 е потребен за трајна синтеза на ниво на позадина;во исто време, потребен е промотер S1 зависен од cAMP-CRP за да се регулира синтезата на високо ниво.Транскрипцијата започнува од ( S2 ) со G и од ( S1 ) без G.
12. Технологијата за рекомбинантна ДНК е позната и како (генско клонирање) или (молекуларно клонирање).Крајната цел е (да се пренесе генетската информација ДНК во еден организам во друг организам).Типичен експеримент за рекомбинација на ДНК обично ги вклучува следните чекори: (1) Извлечете го целниот ген (или егзогениот ген) на донорскиот организам и ензимски поврзете го со друга молекула на ДНК (вектор за клонирање) за да формирате нова рекомбинантна ДНК молекула.② Молекулата на рекомбинантна ДНК се пренесува во клетката примач и се реплицира во клетката примач.Овој процес се нарекува трансформација.③ Проверете ги и идентификувајте ги оние клетки примачи кои ја апсорбирале рекомбинантната ДНК.④Култивирајте ги клетките што содржат рекомбинантна ДНК во големи количини за да откриете дали генот за странска помош е изразен.
13. Постојат два вида на плазмидна репликација: оние кои се строго контролирани со синтезата на протеините на клетката домаќин се нарекуваат (тесни плазмиди), а оние кои не се строго контролирани со синтезата на протеините на клетката домаќин се нарекуваат (релаксирани плазмиди).
14. Системот за реакција на PCR треба да ги има следните услови: а.ДНК прајмери (околу 20 бази) со комплементарни секвенци на секој крај од двете нишки на целниот ген што треба да се одделат.б.Ензими со термичка стабилност како што се: TagDNA полимераза.c, dNTPd, ДНК секвенца од интерес како шаблон
15. Основниот процес на реакција на PCR вклучува три фази: (денатурација), (жарење) и (продолжување).
16. Основниот процес на трансгенските животни обично вклучува: ①Воведување на клониран странски ген во јадрото на оплодената јајце клетка или ембрионска матична клетка;②Трансплантација на инокулираното оплодено јајце или ембрионска матична клетка во женската матка;③ Целосен ембрионски развој и раст За потомството со туѓи гени;④ Користете ги овие животни кои можат да произведат туѓи протеини како добиток за размножување за да размножуваат нови хомозиготни линии.
17. Хибридомските клеточни линии се генерираат со хибридизирање на (слезината Б) клетки со (миелом) клетки, и бидејќи (клетките на слезината) можат да користат хипоксантин и (коскените клетки) да обезбедат функции за клеточна делба, тие можат да се одгледуваат во HAT медиум.расте.
18. Со продлабочувањето на истражувањето, првата генерација на антитела се нарекува (поликлонални антитела), втората генерација (моноклонални антитела) и третата генерација (антитела за генетско инженерство).
19. Во моментов, генетскиот инженеринг на вирусите на инсекти е главно фокусиран на бакуловирус, што се манифестира во воведувањето на (ген за егзогени токсини);(гени кои го нарушуваат нормалниот животен циклус на инсектите);(модификација на вирусни гени).
20. Трансактивните протеински фактори кои одговараат на заедничките елементи TATA, GC и CAAT во промоторот на РНК полимераза II кај цицачите се (TFIID), (SP-1) и (CTF/NF1), соодветно.
Дваесет и еден.Основните фактори на транскрипција на РНК полимеразата Ⅱ се, TFⅡ-A, TFⅡ-B, TFII-D, TFⅡ-E, а нивната сврзувачка низа е: (D, A, B, E).При што функцијата на TFII-D е (обврзувачка за TATA кутијата).
Дваесет и два.Повеќето од факторите на транскрипција кои се врзуваат за ДНК работат во форма на димери.Функционалните домени на факторите на транскрипција кои се врзуваат за ДНК обично се следните (спирала-сврт-спирала), (мотив на прст од цинк), мотив на патент (основен-леуцин).
Дваесет и три.Постојат три типа на режими на расцепување на рестриктивна ендонуклеаза: (сече на 5' страна на оската на симетријата за да се генерираат 5' лепливи краеви), (сече на 3' страна на оската на симетријата за да се генерираат 3' лепливи краеви (сече на оската на симетријата за генерирање рамни сегменти) .
Дваесет и четири.Плазмидната ДНК има три различни конфигурации: (SC конфигурација), (oc конфигурација), (L конфигурација).Првиот во електрофорезата е (SC конфигурација).
25. Системи за експресија на егзогени гени, главно (Ешерихија коли), (квасец), (инсекти) и (табела на клетки од цицачи).
26. Најчесто користени методи за трансгенски животни се: (метод на ретровирусна инфекција), (метод на микроинјекција на ДНК), (метод на ембрионски матични клетки).
Примена Молекуларна биологија
1. Наведете ги функциите на повеќе од 5 РНК?
Трансферна РНК tRNA Трансферна аминокиселина Рибозомска РНК rRNA Рибозомот претставува гласник РНК мРНК Шаблон за синтеза на протеини Хетерогена нуклеарна РНК hnRNA Прекурсор на зрела мРНК мала нуклеарна РНК snRNA Вклучена во спојување на hnRNA Антисмислена РНК anRNA/micRNA Регулира генска експресија Рибозимска РНК Ензиматски активна РНК
2. Која е главната разлика помеѓу прокариотските и еукариотските промотори?
Прокариотски TTGACA --- TATAAT------Место на иницијација-35 -10 Еукариотски засилувач---GC ---CAAT----TATAA-5mGpp-Место на иницијација-110 -70 -25
3. Кои се главните аспекти на вештачката конструкција на природни плазмиди?
Природните плазмиди често имаат дефекти, па затоа не се погодни за употреба како носители за генетско инженерство и мора да се модифицираат и конструираат: а.Додадете соодветни гени за маркери за селекција, како што се два или повеќе, кои се лесни за употреба за селекција, обично антибиотски гени.б.Зголемете или намалете ги соодветните места за сечење на ензимите за да се олесни рекомбинацијата.в.Скратете ја должината, отсечете ги непотребните фрагменти, подобрете ја ефикасноста на увозот и зголемете ја капацитетот на товарење.г.Променете го репликонот, од тесен во лабав, од помалку копии во повеќе копии.д.Додадете посебни генетски елементи според посебните барања на генетскиот инженеринг
4. Наведи пример за метод за диференцијален скрининг на ткивна специфична cDNA?
Се подготвуваат две клеточни популации, целниот ген е изразен или високо изразен во едната од клетките, а целниот ген не е изразен или слабо изразен во другата клетка, а потоа целниот ген се наоѓа со хибридизација и споредба.На пример, за време на појавата и развојот на тумори, клетките на туморот ќе презентираат mRNA со различни нивоа на изразување од нормалните клетки.Затоа, гените поврзани со туморот може да се скринираат со диференцијална хибридизација.Индукцискиот метод може да се користи и за скрининг на гените чија експресија е индуцирана.
5. Генерирање и скрининг на клеточни линии на хибридома?
Б-клетките на слезината + клетките на миеломот, додадете полиетилен гликол (PEG) за да ја промовирате фузијата на клетките, а спленичните Б-миеломски фузиони клетки одгледувани во медиум HAT (содржи хипоксантин, аминоптерин, Т) продолжуваат да се шират.Спојувањето на клетките содржи: спојни клетки слезина-слезина: неможни да растат, клетките на слезината не можат да се култивираат ин витро.Спојувачки клетки на коска-коска: не можат да користат хипоксантин, но можат да синтетизираат пурин преку вториот пат користејќи фолна редуктаза.Аминоптеринот ја инхибира фолатната редуктаза и затоа не може да расте.Клетките на спојување на коските и слезината: можат да растат во HAT, клетките на слезината можат да користат хипоксантин, а коскените клетки обезбедуваат функција на клеточна делба.
6. Кој е принципот и методот на определување на примарната структура на ДНК со методот на дидеокси терминална завршница (Метод Санџер)?
Принципот е да се користи терминатор на нуклеотиден синџир-2,,3,-дидеоксинуклеотид за да се прекине проширувањето на ДНК.Бидејќи му недостасува 3-OH потребен за формирање на 3/5/фосфодиестерски врски, штом еднаш ќе се вградат во синџирот на ДНК, синџирот на ДНК не може дополнително да се прошири.Според принципот на спарување на базите, секогаш кога на ДНК полимеразата ѝ треба dNMP за да учествува во нормално продолжениот ДНК синџир, постојат две можности, едната е да се учествува во ddNTP, што резултира со завршување на проширувањето на деоксинуклеотидниот синџир;другата е да се учествува во dNTP, така што синџирот на ДНК може да продолжи да се протега додека не се инкорпорира следниот ddNTP.Според овој метод, може да се добие група фрагменти на ДНК со различни должини што завршуваат со ddNTP.Методот е да се подели во четири групи соодветно ddAMP, ddGMP, ddCMP и ddTMP.По реакцијата, електрофорезата со полиакриламид гел може да ја прочита секвенцата на ДНК според лентите за пливање.
7. Кое е позитивното регулационо дејство на протеинот активатор (CAP) врз транскрипцијата?
Цикличен аденилат (cAMP) рецепторен протеин CRP (cAMP рецепторен протеин), комплексот формиран од комбинацијата на cAMP и CRP се нарекува CAP (cAMPactivated protein).Кога E. coli се одгледува во средина на која му недостасува гликоза, синтезата на CAP се зголемува, а CAP има функција на активирање на промотори како што е лактозата (Lac).Некои промотери зависни од CRP немаат типична карактеристика на секвенца од -35 региони (TTGACA) што ја имаат обичните промотери.Затоа, тешко е РНК полимеразата да се врзе за неа.Присуството на CAP (функција): може значително да ја подобри константата на врзување на ензимот и промоторот.Главно ги покажува следните два аспекта: ① CAP и помага на ензимската молекула да се ориентира правилно со менување на конформацијата на промоторот и интеракцијата со ензимот, така што ќе се комбинира со регионот -10 и ќе игра улога на замена на функцијата на регионот -35.②CAP, исто така, може да го инхибира врзувањето на РНК полимеразата со други места во ДНК, со што се зголемува веројатноста за врзување со нејзиниот специфичен промотор.
8. Кои чекори обично се вклучени во типичен експеримент за рекомбинација на ДНК?
а.Извлечете го целниот ген (или егзогениот ген) на донорскиот организам и ензимски поврзете го со друга молекула на ДНК (вектор за клонирање) за да формирате нова рекомбинантна ДНК молекула.б.Префрлете ја рекомбинантната ДНК молекула во клетката примач и реплицирајте и зачувајте ја во клетката примач.Овој процес се нарекува трансформација.в.Проверете ги и идентификувајте ги оние клетки примачи кои ја апсорбирале рекомбинантната ДНК.г.Масовно се одгледуваат клетките што ја содржат рекомбинантната ДНК за да се открие дали е изразен генот за странска помош.
9. Изградба на генска библиотека Дадени се три методи за скрининг на рекомбинанти и процесот е накратко опишан.
Скрининг на отпорност на антибиотици, вметнување инактивирање на отпорот, скрининг на сино-бели точки или PCR скрининг, диференцијален скрининг, ДНК сонда Повеќето вектори за клонирање носат гени за отпорност на антибиотици (анти-ампицилин, тетрациклин).Кога плазмидот ќе се пренесе во ешерихија коли, бактериите ќе добијат отпор, а оние без трансфер нема да имаат отпор.Но, не може да разликува дали е реорганизирана или не.Во вектор кој содржи два гени на отпорност, ако туѓ фрагмент на ДНК се вметне во еден од гените и предизвика генот да се деактивира, може да се користат две контроли на плочи кои содржат различни лекови за да се скринираат позитивните рекомбинанти.На пример, плазмидот pUC го содржи генот LacZ (кодирајќи β-галактозидаза), кој може да го разложи хромогениот супстрат X-gal (5-бромо-4-хлоро-3-индол-β-D-галактозид) за да произведе сино, со што сојот станува сино.Кога ќе се вметне странската ДНК, генот LacZ не може да се изрази, а сојот е бел, за да се скринираат рекомбинантните бактерии.
10. Објасни го основниот процес на добивање трансгенски животни преку ембрионски матични клетки?
Ембрионските матични клетки (ES) се ембрионални клетки за време на ембрионалниот развој, кои можат вештачки да се култивираат и размножуваат и да имаат функција да се диференцираат во други типови на клетки.Култура на ES клетки: Внатрешната клеточна маса на бластоцистата е изолирана и култивирана.Кога ES се одгледува во слој без фидер, тој ќе се диференцира во различни функционални клетки како што се мускулните клетки и N-клетките.Кога се одгледува во медиум што содржи фибробласти, ES ќе ја одржува функцијата на диференцијација.ЕС може генетски да се манипулира, а неговата диференцијациска функција може да се интегрира без да влијае на неговата диференцијациска функција, што го решава проблемот на случајна интеграција.Воведување на егзогени гени во ембрионски матични клетки, потоа имплантирајте во матката на бремени женски глувци, развијте во младенчиња и вкрстете за да добиете хомозиготни глувци.
