Cell Direct RT qPCR Kit—SYBR GREEN I Директна клеточна лиза на келии во еден чекор qRT-PCR комплети
Описи
Овој комплет користи уникатен тампон систем за лиза што може брзо да ослободи РНК од примероци од култивирани клетки за RT-qPCR реакции, со што ќе се елиминира процесот на прочистување на РНК кој одзема многу време и макотрпно.Шаблонот за РНК може да се добие за само 7 минути.5-те×Директен RT микс и 2×Директните qPCR Mix-SYBR реагенси обезбедени од комплетот можат брзо и ефикасно да добијат квантитативни PCR резултати во реално време.
5×Директен RT микс и 2×Директниот qPCR Mix-SYBR има силна толеранција на инхибитор, а лизатот на примероците може да се користи како шаблон за RT-qPCR директно.Овој комплет содржи единствена РНК со висок афинитет Foregene реверзна транскриптаза и топла D-Taq ДНК полимераза, dNTPs, MgCl2, пуфер за реакција, PCR оптимизатор и стабилизатор.
Спецификации
200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns
Компоненти на комплетот
| Дел I | Пуфер CL |
| Foregene Protease Plus II | |
| Тампон ST | |
| Дел II | ДНК Бришач |
| 5× Директна RT мешавина | |
| 2× Директен qPCR Mix-SYBR | |
| 50× ROX референтна боја | |
| ddH2O без RNase | |
| Инструкции | |
Карактеристики и предности
■Едноставно и ефективно: со Cell Direct RT технологијата, примероците на РНК може да се добијат за само 7 минути.
■ Побарувачката за примерок е мала, може да се тестираат дури 10 ќелии.
■ Висока пропусност: може брзо да открие РНК во клетките култивирани во плочи со 384, 96, 24, 12, 6 бунари.
■ ДНК Бришачот може брзо да ги отстрани ослободените геноми, во голема мера да го намали влијанието врз последователните експериментални резултати.
■ Оптимизираниот RT и qPCR систем ја прави двостепената RT-PCR реверзна транскрипција поефикасна и PCR поконкретна и поотпорна на инхибиторите на RT-qPCR реакцијата.
Апликација за комплет
Опсег на примена: култивирани клетки.
- РНК ослободена со лиза на примерокот: се применува само за шаблонот RT-qPCR на овој комплет.
- Комплетот може да се користи за следните цели: анализа на генска експресија, верификација на ефектот на замолчување на генот посредуван од siRNA, скрининг на лекови итн.
Дијаграм
Складирање и рок на траење
I дел од овој комплет треба да се чува на 4℃;Дел II треба да се чува на -20℃.
Foregene Protease Plus II треба да се чува на 4℃, не замрзнувајте на -20℃.
Реагенс 2×Direct qPCR Mix-SYBR треба да се чува на -20℃во темница;ако често се користи, може да се чува и на 4℃ за краткорочно складирање (искористување во рок од 10 дена).
Принципи за дизајнирање на прајмер за PCR во реално време
Напреден прајмер и обратен прајмер
За Real Time PCR, дизајнот на прајмерот е многу важен.Прајмерите се поврзани со специфичноста и ефикасноста на засилувањето на PCR и може да се дизајнираат со повикување на следните принципи:
Должина на прајмер: 18-30bp.
Содржина на GC: 40-60%.
Tm вредност: Софтверот за дизајн на Primer, како што е Primer 5, може да ја даде вредноста Tm на прајмерот.Вредностите на Tm на прајмерите нагоре и низводно треба да бидат што е можно поблиску.Може да се користи и формулата за пресметка на Tm: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Кога се изведува PCR, како температура на жарење генерално се избира температура под вредноста на Tm на прајмерот од 5 °C (соодветното зголемување на температурата на жарење може да ја зголеми специфичноста на PCR реакцијата).
Прајмери и PCR производи:
Должината на производот за засилување PCR за дизајн на прајмер е по можност 100-150bp.
Дизајнерските прајмери во секундарната структура на шаблонот треба да се избегнуваат колку што е можно повеќе.
Избегнувајте формирање на 2 или повеќе комплементарни основи помеѓу 3' краевите на прајмерите нагоре и низводно.
Терминалната основа на Primer 3' не може да биде присутна со 3 дополнителни последователни G или C.
Самите прајмери не можат да имаат комплементарни структури, инаку ќе се формира структура на фиба, што ќе влијае на засилувањето на PCR.
ATCG треба да се дистрибуира што е можно подеднакво во прајмерната секвенца, а 3' терминалната база треба да се избегнува како Т.
Додаток 1：Cell Direct RT-qPCR комплет компонентен пакет
1.Раствор за лиза на клетки
|
| |||
| Компоненти на комплетот (24-бунарски систем за лиза / бунар) | DRT-01011-A1 | DRT-01011-A2 | |
| 100 Т | 500 Т | ||
| ДелЈас | Пуфер CL | 20 мл | 100 мл |
| Foregene Protease Plus II | 400 μl | 1 ml × 2 | |
| Тампон ST | 1 ml × 2 | 10 мл | |
| ДелII | ДНК Бришач | 400 μl | 1 ml × 2 |
2.RT Мешај
|
| |
| Компоненти на комплетот (20 μl систем за реакција) | DRT-01011-B1 |
| 200 Т | |
| 5× Директна RT мешавина | 800 μl |
| ddH без RNase2O | 1,7 ml × 2 |
|
| ||
| Компоненти на комплетот (20 μl систем за реакција) | DRT-01011-C1 | DRT-01011-C2 |
| 200 Т | 1000 Т | |
| 2× Директен qPCR Mix-SYBR | 1 ml × 2 | 1,7 ml × 6 |
| 50× ROX референтна боја | 40 μl | 200 μl |
| ddH без RNase2O | 1,7 мл | 10 мл |
Упатства за употреба:
