1. Откријте ја апсорпцијата на растворот на РНК
Апсорпцијата на 280, 320, 230 и 260 nm ги претставува вредностите на нуклеинската киселина, позадината (заматеност на растворот), концентрацијата на сол и органската материја како што е протеинот, соодветно.Генерално гледајте само на OD260/OD280 (сооднос, R).Кога е 1,8~2,0, мислиме дека може да се толерира контаминација на протеин или друга органска материја во РНК, но треба да се забележи дека кога Tris се користи како тампон за откривање на апсорпцијата, вредноста R може да биде поголема од 2 (обично треба да биде <2,2).Кога R<1,8, загадувањето на протеинот или друга органска материја во растворот е поочигледно, а судбината на РНК може да се одреди според потребите.Кога R>2.2, тоа значи дека РНК е хидролизирана во една нуклеинска киселина.
2. Електрофоретска шема на РНК
Генерално, денатурирачкиот гел се користи за електрофореза на РНК, но ако е само за откривање на квалитетот на РНК, гелот за денатурирање не е неопходен, а може да се користи обичен гел од агароза.Целта на електрофорезата е да се открие интегритетот на бендовите 28S и 18S и нивниот сооднос, или интегритетот на брис од mRNA.Општо земено, ако бендовите 28S и 18S се светли, јасни и остри (што се однесува на рабовите на лентите се јасни), а осветленоста на 28S е повеќе од двапати поголема од опсегот 18S, сметаме дека квалитетот на РНК е добар.
Горенаведените се двата методи што најчесто ги користиме, но ниту еден од овие два методи не може јасно да ни каже дали има преостаната RNase во растворот на РНК.Ако има многу мала количина на RNase во растворот, тешко ни е да ја откриеме со горенаведениот метод, но повеќето од последователните ензимски реакции се изведуваат на температура над 37 степени и долго време.На овој начин, доколку има многу мала количина на RNase во растворот на РНК, тогаш ќе има многу погодна средина и време за да ја одиграат својата улога во следните експерименти, и секако експериментот во овој момент ќе биде ладен.Подолу воведуваме метод кој може да потврди дали има резидуална РНаза во растворот на РНК.
3. Тест за зачувување на топлина
Според концентрацијата на примерокот, извлечете две 1000 ng РНК од растворот на РНК и додајте ја во епрувета со центрифуга од 0,5 ml и дополнете ја со pH 7,0 Tris пуфер до вкупен волумен од 10 ul, а потоа затворете го капачето на цевката.Едно од нив се става во водена бања со постојана температура на 70°C и се чува топло 1 ч.Другиот дел се чува во фрижидер -20°C 1 час.Кога ќе истече времето, отстранете ги двата примероци за електрофореза.Откако ќе заврши електрофорезата, споредете ги електрофоретските ленти на двете.Ако лентите од двете се конзистентни или немаат значителна разлика (се разбира, нивните ленти ги исполнуваат условите во методот 2), тоа значи дека нема резидуална контаминација на RNase во растворот на РНК, а квалитетот на РНК е многу добар.Напротив, ако примерокот инкубиран на 70°C покажува очигледна деградација, тоа покажува дека има контаминација со RNase во растворот на РНК.
2 Експериментални методи и техники за екстракција на РНК
Проблемите со кои често се среќаваме при екстракција на РНК се: (1) Приносот на РНК е низок;(2) РНК има сериозно загадување со сол;(3) РНК има сериозно загадување со органски растворувачи;(4) деградација на примерокот и други проблеми
1. Најчесто користени реагенси за екстракција на вкупна РНК
Методот на гванидин изотиоцијанат и методот Тризол се најчесто користени методи за екстракција на вкупната РНК од животински ткива и животински клетки.Посебно е погоден за мали примероци и ткива кои се особено тешки за екстракција, како што е екстракција на вкупна РНК од кожа на зајак и животинско сврзно ткиво;Покрај тоа, Тризол, како реагенс за лиза за општа намена, може да се користи и за екстракција на растителни ткива, бактерии, габи и други ткива.За растителни ткива кои содржат полисахариди и полифеноли, како што се camellia oleifera, листови од чај, семе од репка итн., методот CTAB може да се користи и за екстракција на вкупната РНК.
Како конвенционален метод, методот со двојна колона е исто така многу популарен поради неговата нормална температурна работа, без потреба од додавање RNase и безбедност - без хлороформ, феноли и други органски реагенси за екстракција.(препорачани производи )
2. Екстракција на вкупна РНК од животински ткива
(1) Обидете се да изберете свежо марамче, ако не е свежо (по можност во рок од три месеци - фрижидер 80 ℃ или замрзнато во течен азот. Кога сечете ткиво, не сечете директно на собна температура, задолжително ставете го на кутијата за мраз, обидете се да избегнете повеќекратно замрзнување и одмрзнување.
(2) Користете чисти ножици и пинцети за да исечете мало парче ткиво, обидете се да го пресечете централниот дел од ткивото кога го сечете примерокот или прво пресечете го големото парче ткиво од средината, а потоа исечете го примерокот во положбата на свеж засек.Отстраненото ткиво треба целосно да се распарчи, да се стави ренданото ткиво во EP цевка без RNase, да се додаде лизатот, ренданото ткиво треба да биде целосно изложено на лизатот и да се подготви за хомогенизација.
(3) За нормални ткива, изберете ткива со големина на мунг грав (30-60 mg) за хомогенизација.Ако ткивата содржат голема количина на протеини, масти или густи влакнести ткива како што е црниот дроб, соодветно зголемете или намалете ја количината на исечени ткива (опционално) Изберете 10~20 mg).
(4) Ако се екстрахираат рибни мускули, месо од ракчиња, медуза и други ткива со висока содржина на вода, волуменот на примерокот треба соодветно да се зголеми (се препорачува 100-200 mg).
(5) Доколку условите дозволуваат, животинското ткиво може директно да се екстрахира откако ќе се хомогенизира со хомогенизатор на ткиво со висок премин, доколку не постои таква опрема.
(6) РНК добиена по финалната екстракција мора веднаш да се стави на ледената кутија за да се намали разградувањето на РНК.
3. Екстракција на РНК од животинска клетка
(1) Ќелии за суспензија: центрифугирајте директно и фрлете го медиумот, измијте го со стерилен PBS 1-2 пати, потоа суспендирајте со соодветна количина на PBS, а потоа додадете лизат за лиза.Не додавајте го лизатот директно во таложените клетки откако целосно ќе ја исфрлите течноста.Ова ќе предизвика хистонското пакување ослободено по лизираните клетки на надворешниот слој да се залепат на надворешната страна на таложените ќелии, со што ќе се ограничи контактот на клетките во пелетот со лизатот., што резултира со нецелосна клеточна лиза и намален принос на РНК.
(2) Клетки што се полулепливи или не цврсто прилепени: Откако ќе го исфрлите медиумот, измијте го со PBS 1-2 пати, потоа директно апсорбирајте соодветна количина на PBS и издувате го садот за култура со пипета или пиштол за да ги издувате клетките и префрлете ги во клетки без РНК.Додадете го лизатот во EP цевката на ензимот за екстракција.
(3) Ахерентни клетки: прво треба да се дигестираат со трипсин, потоа да се соберат во EP цевки без RNase, да се центрифугира за да се отстрани супернатантот, да се мијат 1-2 пати со PBS за да се отстрани вишокот на трипсин и повторно да се суспендира со соодветна количина на PBS. Потоа продолжете со чекорот на екстракција.
4. Екстракција на растителна РНК
Растителните ткива се богати со фенолни соединенија или богати со полисахариди или содржат некои неидентификувани секундарни метаболити или имаат висока активност на RNase.Овие супстанции се цврсто комбинирани со РНК по клеточната лиза за да формираат нерастворливи комплекси или колоидни талози, кои тешко се отстрануваат.Затоа, кога извлекуваме растително ткиво, треба да избереме комплет за растенија.Лизатот во комплетот може ефикасно да ги реши проблемите со лесната оксидација на полифенолите и одвојувањето на полисахаридните соединенија и нуклеинските киселини.
(За екстракција на растителна РНК од полисахарид полифенол, препорачани производи:
(1) Кората, пулпата, семките, листовите и слично на растението треба целосно да се сомелат во малтер.За време на процесот на мелење, течниот азот треба да се наполни навреме за да се избегне топење на примерокот.Мелениот примерок треба брзо да се додаде во лизатот и да се протресе за да се избегне деградација на РНК.
(2) За примероците богати со влакна, како што се лисјата од ориз и пченица, количината на екстракција треба соодветно да се намали, инаку мелењето и лизата на ткивото нема да бидат комплетни, што ќе резултира со низок принос на екстрахирана РНК.
(3) За растителни ткива со висока содржина на вода, како што се овошјето од калинка, овошје од лубеница, овошје од праска итн., големината на примерокот треба соодветно да се зголеми (100-200 mg е изборна).
(4) Растителните ткива, како што се лисјата на растенијата, ризомите, тврдите плодови и другите материјали генерално се препорачуваат да користат течен азот за темелно малтерирање на состојките во малтер, а потоа да се продолжи со чекорот на екстракција.Конвенционалните ткивни хомогенизатори можеби не се ефикасни во хомогенизирање на растителните ткива и генерално не се препорачуваат.
5. Мерки на претпазливост за екстракција на РНК
(1) Примероците од ткиво треба да бидат колку што е можно свежи за да се избегне повторено замрзнување и одмрзнување.
(2) Ткивото треба да биде целосно сомелено за време на екстракцијата, а количината на ткивото не треба да биде премала, а камоли премногу.
(3) Треба да се даде доволно време на инкубација по додавањето на лизатот за целосно да се лизи примерокот.
(4) При користење на методот Trizol за екстракција, принципот на апсорпција на супернатантот по стратификацијата е „повеќе да се вдишува отколку да се вдишува повеќе“, и не смее да се екстрахира до средниот слој, во спротивно ќе предизвика сериозна геномска контаминација на ДНК.
(5) При перење, течноста за перење треба целосно да се инфилтрира околу ѕидот на цевката за да се обезбеди темелно миење.
(6) За методот на екстракција со колона, покрај одвојувањето на колоната по миењето, адсорпционата колона треба да се стави и во ултра чиста клупа и да се дува 5-10 минути за целосно испарување на органскиот растворувач до сувост.
(7) При последното елуирање на методот на колона, по додавањето на DEPC вода, таа треба да се инкубира 3-5 минути или водата DEPC треба да се загрее на 60°C однапред за да се зголеми приносот на елуцијата.Во традиционалниот метод на расцепување Тризол и таложење со изопропанол, конечната РНК се раствора во вода DEPC, така што треба да се даде соодветно време за растворање, а дното на цевката од центрифугата треба постојано да се дува со врв од пипета.
3 Тhree Причини и решенија за ниска концентрација на РНК/лош квалитет
1. Приносот е премногу низок
Извадениот примерок е премногу низок, вкупната количина е недоволна или извадениот примерок е премногу и лизата не е целосна;ткивото или клетките со соодветен квалитет треба да се користат за екстракција, пред-третманот на примерокот мора да се направи добро, а лизата треба да биде доволна.
2. Остатоци од геном
При екстракција со методот Тризол, кога супернатантот се вшмукува во средниот слој по раслојувањето, ќе се предизвика сериозна контаминација на геномот;треба дополнително да се внимава при раслојување за да се избегне вшмукување во средниот слој.Ако методот на колона се користи за екстракција, комплет што содржи DNase I може да се избере за екстракција.Нуклеинската киселина адсорбирана на мембраната директно се вари со DNase I, што во голема мера може да ги намали остатоците од ДНК.
3. Деградација на РНК
Тоа може да биде деградација на самата извлечена мостра или деградација предизвикана во текот на процесот на екстракција;колку што е можно, свежи примероци треба да се користат за екстракција на РНК, а собраните примероци треба навреме да се чуваат во течен азот или во фрижидер -80°C и да се избегнува повторено замрзнување и одмрзнување.Во процесот на екстракција на РНК треба да се користат врвови без RNase/DNase, цевки за центрифугирање и други материјали.Процесот на екстракција треба да биде што е можно побрз.Извлечената РНК треба да се стави на кутија со мраз и да се чува на -80 во времето.Доколку извлечената РНК треба да се открие со гел електрофореза, веднаш по екстракцијата треба да се изврши електрофореза, а пуферот за електрофореза да се замени со новоприготвен.
4. Остатоци од сол и органски растворувачи
Реагенсите за екстракција содржат соли на фенол и гванидин, а растворот за перење содржи етанол.За време на процесот на екстракција, лизатот не беше целосно апсорбиран и фрлен, а растворот за перење не беше целосно сушен.Резидуалните соли и органските растворувачи се штетни за последователната обратна транскрипција и PCR.Различни степени на инхибиција, така што лизатот на ткивото треба целосно да се отстрани за време на процесот на екстракција, а миењето треба да биде доволно за да може да се измијат околните ѕидови на цевката.Покрај тоа, цевката се празнат и дува е неопходен чекор, што дополнително ќе ги намали остатоците од органска материја.
За повеќе информации за екстракција на РНК, ве молиме следете ја нашата веб-страница:
www.foreivd.com за повеќе информации.
Време на објавување: Декември-01-2022 година
