Добро е познато дека во централната догма, РНК е транскрипцискиот посредник помеѓу ДНК и протеинската експресија.Во споредба со детекцијата на ДНК, откривањето на РНК може пообјективно да ја одрази генската експресија во организмите.Експериментите кои вклучуваат РНК вклучуваат: qRT-PCR, RNA-Seq и детекција на фузионен ген, итн. Врз основа на карактеристиките на самата РНК (шеќерниот прстен на РНК има една повеќе слободна хидроксилна група од шеќерниот прстен на ДНК), заедно со голем број RNase во околината, РНК е понестабилна и полесно се разградува од ДНК.Влегува ѓубре, ѓубре надвор, ако квалитетот на РНК не е добар, тогаш експерименталните резултати мора да бидат незадоволителни, конкретно манифестирани како неточни податоци или слаба повторливост.Затоа, треба да се посвети поголемо внимание на обработката на РНК, а врската за контрола на квалитетот е исто така поважна за да се обезбеди прецизност и точност на последователните експериментални податоци.

За контрола на квалитетот на РНК, обично постојат следниве најчесто користени методи:

• Спектрофотометрија
• Електрофореза со гел агароза
• Агилентен биоанализатор
• флуоресцентна квантитативна PCR во реално време
• Qubit флуоресцентна боја метод

01 Спектрофотометрија

РНК има конјугирани двојни врски и има врв на апсорпција на бранова должина од 260 nm.Според законот на Ламберт-Бир, можеме да ја пресметаме концентрацијата на РНК од врвот на апсорпција на 260 nm.Покрај тоа, можеме да ја пресметаме и чистотата на РНК според односот на врвовите на апсорпција од 260 nm, 280 nm и 230 nm.280 nm и 230 nm се врвовите на апсорпција на протеините и малите молекули, соодветно.Односот на A260/A280 и A260/A230 на квалификувана чистота на РНК треба да биде поголем од 2. Ако е помал од 2, тоа значи дека има контаминација со протеини или мала молекула во примерокот на РНК и треба повторно да се прочисти.Изворите на контаминација ќе влијаат на низводните експерименти, како што е инхибирање на ефикасноста на засилување на PCR реакциите, што ќе резултира со неточни квантитативни резултати.Чистотата на РНК има големо влијание врз последователните резултати, така што спектрофотометријата е генерално незаменлива врска за контрола на квалитетот во првиот чекор во експериментите со нуклеинска киселина.

Слика 1. Типичен спектар на апсорпција на РНК/ДНК

02 Електрофореза со гел агароза

Покрај чистотата, интегритетот на РНК е исто така еден од важните индикатори за оценување на квалитетот на РНК.Деградацијата на РНК ќе доведе до голем број кратки фрагменти во примерокот, така што ќе се намали бројот на фрагменти на РНК кои можат ефективно да се детектираат и опфатат со референтната секвенца.Интегритетот на РНК може да се провери со електрофореза на вкупната РНК на 1% гел агароза.Овој метод може сами да го конфигурирате гелот или да го користите префабрикуваниот систем E-Gel™ за тестирање на интегритетот.Повеќе од 80% од вкупната РНК е рибозомална РНК, чие мнозинство е составено од 28S и 18S rRNA (во системи на цицачи).РНК со добар квалитет ќе покаже две очигледни светли ленти, кои се 28S и 18S светли ленти, соодветно, на 5 Kb и 2 Kb, а односот ќе има тенденција да биде блиску до 2:1.Ако е во дифузна состојба, тоа значи дека примерокот на РНК можеби е деградиран и се препорачува да се користи методот опишан подоцна за дополнително тестирање на квалитетот на РНК.

Слика 2. Споредба на деградирана (лента 2) и недопрена РНК (лента 3) на електрофореза со гел агароза

03 Агилентен биоанализатор

Покрај методот на електрофореза на агарозен гел опишан погоре, кој може да ни помогне да го идентификуваме интегритетот на РНК едноставно и брзо, можеме да го користиме и биоанализаторот Agilent за да го одредиме интегритетот на РНК.Користи комбинација од микрофлуиди, капиларна електрофореза и флуоресценција за да се процени концентрацијата и интегритетот на РНК.Со користење на вградениот алгоритам за анализа на профилот на примерокот на РНК, биоанализаторот Agilent може да пресмета референтна вредност на интегритет на РНК, РНК интегритет број (во натамошниот текст: RIN) [1].Колку е поголема вредноста на RIN, толку е поголем интегритетот на РНК (1 е екстремно деградирана, 10 е најкомплетна).Некои експерименти кои вклучуваат РНК сугерираат користење на RIN како параметар за проценка на квалитетот.Земајќи ги експериментите за секвенционирање со голема моќност (во понатамошниот текст NGS) како пример, насоките на Oncomine™ Human Immune Repertoire, кој се користи за откривање на рецепторите на Б-клетките и Т-клеточните антигени во серијата панели на Thermo Fisher's Oncomine, сугерираат дека примероците со RIN вредности поголеми од 4, може да се прочитаат поефективни мерки 3.Постојат различни препорачани опсези за различни панели и често повисок RIN може да донесе поефикасни податоци.

Слика 3, во експериментите со човечки имунолошки репертоар Oncomine™, примероците со RIN поголем од 4 можат да откријат поефикасни отчитувања и клонови на Т-клетките.【2】

Сепак, вредноста на RIN исто така има некои ограничувања.Иако RIN има висока корелација со квалитетот на NGS експерименталните податоци, тој не е погоден за FFPE примероци.Примероците FFPE се хемиски третирани долго време, а извлечената РНК генерално има релативно ниска вредност на RIN.Сепак, тоа не значи дека ефективните податоци од експериментот мора да бидат незадоволителни.За прецизно да го процениме квалитетот на FFPE примероците, треба да користиме мерења различни од RIN.Покрај RIN, биоанализаторот Agilent може да ја пресмета вредноста на DV200 како параметар за проценка на квалитетот на РНК.DV200 е параметар кој ја пресметува пропорцијата на фрагменти поголеми од 200 bp во примерок од РНК.DV200 е подобар показател за квалитетот на примерокот FFPE од RIN.За РНК извлечена од FFPE, таа има многу висока корелација со бројот на гени кои можат ефективно да се детектираат и разновидноста на гените [3].Иако DV200 може да ги надомести недостатоците во откривањето на квалитетот на FFPE, биоанализаторот Agilent сè уште не може сеопфатно да ги анализира проблемите со квалитетот во примероците на РНК, вклучително и дали има инхибитори во примероците.Самите инхибитори можат да влијаат на ефикасноста на засилување на низводните експерименти и да ја намалат количината на корисни податоци.За да знаеме дали има инхибитор во примерокот, можеме да го примениме флуоресцентниот квантитативен PCR метод во реално време опишан понатаму.

04 флуоресцентна квантитативна PCR во реално време

Флуоресцентниот квантитативен PCR метод во реално време не само што може да ги открие инхибиторите во примерокот, туку и точно да го одрази квалитетот на РНК во примерокот FFPE.Во споредба со биолошките анализатори Agilent, квантитативните инструменти со флуоресценција во реално време се попопуларни во големите биолошки лаборатории поради нивната поширока примена.За да го тестираме квалитетот на примероците на РНК, потребно е само да купиме или подготвиме прајмерни сонди за внатрешни референтни гени, како што е GUSB (Cat бр. Hs00939627).Со користење на овој сет на прајмери, сонди и стандарди (вкупна РНК со позната концентрација) за спроведување на апсолутни квантитативни експерименти, ефективната концентрација на фрагментот на РНК може да се пресмета како стандард за евалуација на квалитетот на РНК (накратко Функционална РНК квантитација (FRQ)).Во NGS тест, откривме дека FRQ на примероците на РНК има многу висока корелација со ефективниот волумен на податоци.За сите примероци поголеми од 0,2ng/uL FRQ, најмалку 70% од читањата можат ефективно да ја покријат референтната секвенца (Слика 4).

Слика 4, вредноста на FRQ откриена со квантитативниот метод на флуоресценција има многу висока корелација (R2>0,9) со ефективни податоци добиени во експериментот NGS.Црвената линија е вредноста на FRQ еднаква на 0,2 ng/uL (log10 = -0,7).【4】

Покрај тоа што е применлив за примероците FFPE, методот на квантитативна PCR во реално време може ефикасно да ги следи и инхибиторите во примероците.Можеме да го додадеме примерокот што треба да се открие во системот за реакција со внатрешна позитивна контрола (IPC) и нејзината анализа, а потоа да извршиме квантификација на флуоресценција за да ја добиеме вредноста на Ct.Ако вредноста на Ct заостанува зад вредноста на Ct во реакцијата без примерок, тоа покажува дека инхибиторот е присутен во примерокот и ја инхибира ефикасноста на засилување во реакцијата.

05 Кјубитна флуоресцентна боја метода

Qubit флуорометарот е најчесто користениот мал уред за откривање на концентрација и чистота на нуклеинска киселина, кој е лесен за ракување и постои во речиси секоја лабораторија за молекуларна биологија.Прецизно ја пресметува концентрацијата на нуклеинската киселина со откривање и флуоресцентна боја што се врзува за нуклеинска киселина (реагенс за откривање Qubit).Qubit има висока чувствителност и специфичност и може точно да ја квантифицира РНК до концентрацијата на pg/µL.Покрај добро познатата способност за прецизно квантифицирање на концентрацијата на нуклеинска киселина, најновиот нов модел на Thermo Fisher, Qubit 4.0, исто така може да го открие интегритетот на РНК.Системот за откривање на РНК Qubit 4.0 (RNA IQ Assay) го детектира интегритетот на РНК со истовремено откривање на две специфични флуоресцентни бои.Овие две флуоресцентни бои можат да се врзат за големи фрагменти и мали фрагменти од РНК, соодветно.Овие две флуоресцентни бои укажуваат на пропорцијата на големи фрагменти од РНК во примерокот, и од ова може да се пресмета вредноста на IQ (интегритет и квалитет) што го претставува квалитетот на РНК.Вредноста на коефициентот на интелигенција е применлива и за FFPE и за не-FFPE примероци и има големо влијание врз последователниот квалитет на секвенционирање.Земајќи ги NGS експериментите како пример, во експериментите за тестирање RNA-Seq извршени на платформата Ion torrent™, повеќето примероци со вредности на коефициент на интелигенција поголеми од 4 имале најмалку 50% ефективни читања (Слика 5).Во споредба со горенаведените методи за откривање, Qubit IQ Assay не само што е поудобно за работа и одзема помалку време (во рок од пет минути), туку исто така има голема корелација помеѓу измерената вредност на параметарот IQ и квалитетот на податоците на низводните експерименти.

Слика 5, постои голема корелација помеѓу Qubit RNA IQ вредноста и мапираните читања на RNA-Seq.【5】

Преку горниот вовед, верувам дека секој има доволно разбирање за различните методи за контрола на квалитетот на РНК.Во пракса, можете да изберетесоодветниот метод според типот на примерокот и постојните инструменти.Само со добро контролирање на квалитетот на РНК можеме да избегнеме неуспех на последователните експерименти предизвикани од лошиот квалитет на примерокот, со што ќе заштедиме драгоцено време, енергија и трошоци.

Референтни производи:

Комплет за изолација на тотална РНК на животните

Комплет за изолација на тотална РНК на клетките

референци

【1】Шредер, А., Мулер, О., Стокер, С. и сор.RIN: број на интегритет на РНК за доделување вредности на интегритет на мерењата на РНК.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Корисничко упатство за човечки имунолошки репертоар на Oncomine (Бр. пуб. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Леа Ц Вемас, Чарлс Е Вуд, Брајан Н.Чорли, Керол Л Јаук, Гејл М Нелсон, Сузан Д Хестер, Метрика за подобрен квалитет за проценка на РНК изведена од архивски примероци на ткиво фиксирани со формалин, вградени парафини, токсиколошки науки, август 20, токсиколошки науки 1, токсиколошки науки 1,17, 57-373,https://doi.org/10.1093/toxsci/