Ние сме биле искусен производител.Освојување на мнозинството во клучните сертификати на својот пазар за големи попусти во Кина со висока чувствителност во еден чекор сонда Rt-QpcrКомплет V2, Квалитетот е фабрички живот, Фокусот на побарувачката на клиентите е извор на опстанок и развој на компанијата, Ние се придржуваме до чесноста и добронамерниот работен став, со нетрпение го очекуваме вашето доаѓање!
Ние сме биле искусен производител.Освојување на мнозинството во клучните сертификати на својот пазар заКина Так ДНК полимераза, Qpcr, Нашата компанија ветува: разумни цени, кратко време на производство и задоволителна услуга по продажбата, исто така ви посакуваме добредојде да ја посетите нашата фабрика во секое време што сакате.Посакувам сега да имаме пријатен и долгорочен бизнис заедно!!!

Описи

Овој комплет користи уникатен тампон систем за лиза што може брзо да ослободи РНК од примероци од култивирани клетки за RT-qPCR реакции, со што ќе се елиминира процесот на прочистување на РНК кој одзема многу време и макотрпно.Шаблонот за РНК може да се добие за само 7 минути.5×Direct RT Mix и 2×Direct qPCR Mix-SYBR реагенсите обезбедени од комплетот можат брзо и ефикасно да добијат квантитативни PCR резултати во реално време.

5×Direct RT Mix и 2×Direct qPCR Mix-SYBR имаат силна толеранција на инхибитор, а лизатот на примероците може да се користи како шаблон за RT-qPCR директно.Овој комплет содржи единствена РНК со висок афинитет Foregene реверзна транскриптаза и топла D-Taq ДНК полимераза, dNTPs, MgCl₂, пуфер за реакција, PCR оптимизатор и стабилизатор.

Спецификации

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Компоненти на комплетот

Карактеристики и предности

■ Едноставно и ефективно: со Cell Direct RT технологијата, примероците на РНК може да се добијат за само 7 минути.

■ Побарувачката за примерок е мала, може да се тестираат дури 10 ќелии.

■ Висока пропусност: може брзо да открие РНК во клетките култивирани во плочи со 384, 96, 24, 12, 6 бунари.

■ ДНК Бришачот може брзо да ги отстрани ослободените геноми, во голема мера да го намали влијанието врз последователните експериментални резултати.

■ Оптимизираниот RT и qPCR систем ја прави двостепената RT-PCR реверзна транскрипција поефикасна и PCR поконкретна и поотпорна на инхибиторите на RT-qPCR реакцијата.

Апликација за комплет

Опсег на примена: култивирани клетки.

- РНК ослободена со лиза на примерокот: се применува само за шаблонот RT-qPCR на овој комплет.

- Комплетот може да се користи за следните цели: анализа на генска експресија, верификација на ефектот на замолчување на генот посредуван од siRNA, скрининг на лекови итн.

Дијаграм

Складирање и рок на траење

I дел од овој комплет треба да се чува на 4℃;Дел II треба да се чува на -20℃.

Foregene Protease Plus II треба да се чува на 4℃, не замрзнувајте на -20℃.

Реагенсот 2×Direct qPCR Mix-SYBR треба да се чува на -20℃ во темница;ако се користи често, може да се чува и на 4℃ за краткорочно складирање (искористување во рок од 10 дена). Имаме искусен производител.Освојување на мнозинството во клучните сертификати на нејзиниот пазар за големите попусти Кина Комплет Rt-Qpcr со висока чувствителност во еден чекор V2, Квалитетот е фабрички век, Фокусот на побарувачката на клиентите е извор на опстанокот и развојот на компанијата, Ние се придржуваме до чесноста и добрата волја на работниот став, со нетрпение го очекуваме вашето доаѓање!
Голем попустКина Так ДНК полимераза, Qpcr, Нашата компанија ветува: разумни цени, кратко време на производство и задоволителна услуга по продажбата, исто така ве поздравуваме да ја посетите нашата фабрика во секое време што сакате.Посакувам сега да имаме пријатен и долгорочен бизнис заедно!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Такмan

Кат.бр.ДРТ-01021/01022

За клеточен директен RT-qPCR користејќи ≤ 1000.000 клетки

Воведување на производот

Овој производ користи уникатен пуфер систем за лиза за брзо ослободување на РНК од примероци од култивирани клетки за RT-qPCR реакции, елиминирајќи го процесот на прочистување на РНК кој одзема многу време и макотрпен, и само 7 минути за да се добие потребната РНК шаблон, со 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman може брзо и ефикасно да се добијат резултати од kPCR.

5× Direct RT Mix и 2× Direct qPCR Mix-Taqman имаат силна толеранција на инхибитор и може да изврши ефикасно превртување и специфично засилување користејќи го лизатот на примерокот што треба да се мери како шаблон.Реагенсот содржи Foregene реверзна транскриптаза, топла D-Taq ДНК полимераза, dNTPs, MgCl₂, Реакција пуфер, PCR оптимизатор и стабилизатор, кој може да се користи со тампон за лиза за брзо и лесно откривање примероци и има карактеристики на висока чувствителност, специфичност и стабилност.

Карактеристики на производот

Едноставна, ефикасна Cell Direct RT технологија за која се потребни само 7 минути за да се добијат примероци од РНК.

Барањата за примероци се мали, а за експериментирање може да се користат минимум 10 култивирани клетки.

Висока пропусност за брзо стекнување на РНК на култивирани клетки како што се 384, 96, 24, 12 и 6-бунарски плочи.

ДНК Бришачот е во состојба брзо да ги отстрани ослободените геноми, што значително го намалува влијанието врз последователните експериментални резултати.

Оптимизираните RT и qPCR системи овозможуваат двостепен RT-PCR со поефикасна обратна транскрипција, специфичност и посилна толеранција на инхибиторот на реакцијата RT-qPCR.

Апликација за комплет

Опсег на примена: Културни клетки.

Лиза на примерок интерпретирана РНК: се користи само како шаблон RT-qPCR во два чекора.

Комплетите може да се користат за следните цели: анализа на регулаторната експресија на гените, тестирање на алели, скрининг на лекови итн.

Ограничувања на комплетот

Засилени фрагменти ≤ 300 bp.

Комплетите се користат за свежо одгледување на клетки.

Контрола на квалитетот на производот

Според системот за управување со вкупен квалитет на FOREGENE, секоја серија од комплетите од серијата Cell Direct RT-qPCR е ригорозно тестирана повеќе пати за да се обезбеди сигурност и стабилност на квалитетот на секоја серија комплети.

Содржина на комплетот

*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman може да се купат посебно, деталите се дадени во Додаток 1 (СТРАНИЦА 13).

Услови за складирање

1. Услови за испорака

Целиот процес на транспортирање на кутијата со мраз на ниска температура, за да се осигура дека комплетот е во состојба <4 °C.

2. Услови за чување

Чувајте го делот I на 4°C и делот II на -20°C.

Foregene Protease Plus II треба да се чува на 4°C, а не замрзнат на -20°C.

Реагенсот 2× Direct qPCR Mix-Taqman се чува на -20°C или на 4°C за краткорочна употреба доколку често се користи (во рок од 10 дена).

Информации за компонентата на комплетот

Пуфер CL: Обезбедува средина потребна за реакции на лиза на клетките.

Пуфер ST: Ја прекинува активната супстанција во лизатот за да избегне ефекти врз последователните RT.

ДНК Бришач: Отстранувач на ДНК, ефектот на отстранување на геномот на следните експерименти.

5× Директна RT мешавина: Содржи Foregene реверзна транскриптаза со висок афинитет на РНК, инхибитор на RNase, dNTPs, стабилизатори, засилувачи, оптимизатори и прајмери ​​за обратна транскрипција за оптимално усогласување (Случаен прајмер, Олиго(dT)₁₈Прајмер).

Foregene Protease Plus II: Во контекст на пуферот за лиза, клетките се лизираат за да се ослободат нуклеинските киселини.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: Овој реагенс содржи топла D-Taq ДНК полимераза, dNTPs, MgCl₂, пуфер за реакција, PCR оптимизатор и стабилизатор.

20× ROX референтна боја: Генерално се користи на инструменти за засилување на PCR во реално време на ABI, Stratagene и други компании, се користи за прилагодување на разликата помеѓу PCR цевките и цевките предизвикани од грешки во дозирањето на PCR.Концентрацијата на референтната боја 20× ROX потребна за различни инструменти е различна, а корисникот може да ја додаде според препорачаната концентрација на инструментот.

ddH без RNase₂О: Стерилизирана ултра чиста вода без RNase за RT-qPCR реакции во два чекора.

Мерки на претпазливост:(Задолжително прочитајте ги внимателно мерките на претпазливост пред да го користите комплетот)

Обрнете внимание на методот на работа на експериментот за да избегнете вкрстена контаминација помеѓу примероците.

Обрнете внимание на чистотата на експерименталната средина и приборот за да избегнете контаминација на RNase и деградација на РНК.

Земете свежи или добро сочувани клеточни примероци и никогаш не користете повторени примероци на клетки замрзнати-одмрзнати.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman треба да избегнува повторено замрзнување-одмрзнување, во спротивно тоа ќе влијае на обратната транскрипција и ефикасноста на PCR.

Препаоброципредоперација

Внимателно прочитајте ги упатствата пред да го користите овој комплет.Комплетот Cell Direct RT-qPCR е едноставен, удобен и брз за ракување, а упатствата даваат целосни информации за целиот комплет и како правилно да го користите.Ве молиме подгответе ги потребните експериментални материјали и опрема пред употреба.

Експериментални материјали и опрема

◆ Културни клетки.

◆ 1,5 ml или 2 ml, цевче за центрифуга без RNase-/DNase, врв без RNase-/DNase, стерилна qPCR цевка од 0,2 ml.

◆ qPCR машина, пипета, центрифуга на маса (≥13.400×е) (во зависност од експерименталните потреби) итн.

Безбедност

◆ Овој производ е само за научно-истражувачки цели, ве молиме не го користете за фармацевтски, клинички, прехранбени и козметички цели.

◆ Кога користите хемикалии, носете соодветна лабораториска облека, ракавици, заштитни очила итн.

Операцијаводичи

Системите за клеточна лиза, RT системите и пакетите за додатоци со раствор за реакција qPCR може да се купат одделно, за детали во Додаток 1 (СТРАНИЦА 13).

Упатство за работа

О: Ослободување на РНК примерок

1. Клетките беа претходно третирани: измијте ја плочата за клеточна култура со ладна PBS, а потоа лизирајте ги клетките (10-10⁶), 10⁶ од количината на клетки, се препорачува Foregene the Cell and RNA Isolation Kit the Total (DE-03111) или Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) за екстракција и прочистување на РНК.

1.1.Прилепени клетки (плоча со 24 бунари како пример)

1.1.1.Определете го бројот на клетки во секоја бунар, утврдете дека бројот на клетки е 1 × 10⁵, и користете пипета за да го отстраните медиумот за култура од садот за култура.

1.1.2.Додадете 200 μl претходно разладено 1 × PBS во секоја бунар.Не пипетирајте повеќепати и отстранувајте го PBS од бунарите.Навалете ја плочата и извадете колку што е можно повеќе PBS.Продолжете на чекор 2.

1.1.3.Различна чинија за клеточна култура или табела со референтен број 1-1 во сад за клеточна култура беше додадена претходно изладена 1 × PBS за миење на клетките.

Табела 1-1: Дозирање на PBS за различен број клетки

Забелешка:За да се обезбеди цврсто прилепени клетки,се избегнува голем број на губење на клетки при перење.

1.2.Клетките на суспензија или адхерентни клетки култивирани во непорозни плочи

1.2.1.Ахерентните клетки култивирани во не-повеќе бунарски плочи (клетките на суспензија започнуваат од следниот чекор 1.2.2), собирајте ги и одделете ги клетките според нормалниот метод на собирање на клетките и ставете ги во културна плоча или цевка за центрифугирање;ако се користи трипсинизација, потребна е центрифугирање за да се соберат клетките и да се отстрани резидуалниот трипсин, додадени PBS ресуспендирани клетки во поединечни клетки за да се дисперзираат клетките.

1.2.2.По бројот на изброени ќелии, аликвотирани ќелии 1×10⁵ еден за центрифугирање на цевки, собирајте клетки со центрифугирање на 1000 × g за 10 мин.

1.2.3.Додадете 200 μl PBS во цевката за центрифуга, не пипетирајте повеќекратно и директно аспирирајте го PBS.продолжете со чекор 2. (Ако е тешко да се таложи и клетките се повторно суспендирани, може да се изведат 1000×g центрифугирани 10 мин по фрлањето на супернатантот, клеточната пелета продолжи на чекор 2)

2. Лиза на клетките: Отстранете го пуферот CL, неговата температура избалансирана на собна температура, ДНК бришачот и Foregene Protease Plus II, според следната табела 1-2 подготвен систем за лиза: (Растворот за лиза е подготвен за употреба).

Табела 1-2: расцеп подготовка на системот (Забелешка: во подготовка на мраз)

3. ( Плоча од 24 бунари како пример ) Пипетајте 200 μl од мастер микс за лиза на клетките во секоја бунар, постојано дувајте 5-10 пати, инкубирајте на собна температура (20-25 ℃) 5 мин.

Забелешка:За да се избегне формирање на меурчиња, ве молиме кога скалата на пипетата беше прилагодена на 200μl или помалку.Клетките може да изгледаат заматени по лизата, што е нормално.

4. (24-бунарска плоча како пример) се додава во течноста 20 μl пуфер ST (различни системи за лиза Пуфер ST додаден во количина прикажана во Табела 1-3), се повторува пипетирањето 5-10 пати, на собна температура (20-25 ℃) се инкубираат 2 мин.

Забелешка:Врвот на пипетата е поставен под површината, осигурувајќи дека е додаден лизатот,за да се избегне формирање на меурчиња, ве молиме кога скалата на пипетата беше прилагодена на 200μl или помалку.

Табела 1-3:Додадете тампон ST

5. Лизатот се користи за последователни RT-qPCR експерименти.Ако следните експерименти не можат да се изведат навреме, ве молиме чувајте го на мраз не повеќе од 2 часа и чувајте го на -20℃ или -80 ℃ (не повеќе од три месеци).

Б: Подготовка на RT системот

1.Извадете го 5 × Direct RT Mix и ставете го на ледена бања, оставете го да се стопи природно и нежно измешајте го за подоцнежна употреба;извадете го ddH2O без RNase и стопете го и ставете го на ледена бања за подоцнежна употреба.Подгответе го системот за реакција на мраз според Табела 2-1 подолу.

Табела 2-1: Подготовка на RT систем за реакција

2. По завршувањето на формулацијата на системот, нежно се меша и накратко се центрифугира во следната табела 2 -2 услови на реакција RT реакција.

Табела 2-2: Поставување на состојбата на RT реакција

3.По завршувањето на реакцијата, производот за реакција беше ставен директно на мраз за qPCR, ве молиме ставете го долгорочното зачувување -20℃ или -80 ℃.

Забелешка: Поради употребата на непрочистен шаблон, може да се појават бели талози во производот за обратна транскрипција.Ова е нормален феномен.Веднаш центрифугирајте го супернатантот за последователни експерименти.

Резултирачкиот раствор на RT реакција се додава на следниот чекор во реално време PCR системи за реакција, се препорачува да се додадат количини кои се движат од 10-30% од системот за реакција.

C: подготовка на системот за реакција на qPCR

1. Соодветно количество Б подготвено во шаблонот cDNA во чекор според следната табела 3-1 за да се подготви систем за реакција.

Забелешка: Количината на шаблонот cDNA изнесува 10-30% од qPCR системот.На пример, во 20 μl qPCR систем, додадете 2-6 μl пуфер за лиза, но не повеќе од 6 μl.

2. Добрите услови за оптимизација qPCR (температура на жарење итн.) за qPCR реакција (Условите на реакција дадени во Табела 3-2).

Забелешка: Обидете се да користите оптимизирани услови за qPCR реакции за да добиете подобри резултати.

Табела 3-1: Подготовка на систем за реакција на PCR

1*: Концентрацијата на прајмер може да се прилагоди во опсег од 50-900 nM кога перформансите на реакцијата на прајмерот се слаби.

Забелешка: qPCR системот може да се прилагоди според експерименталните потреби и моделот на флуоресцентен циклус.За qPCR во 50μl систем, прилагодете ја дозата на реагенсот пропорционално според 20μl систем.

2*: Изберете ја соодветната конечна концентрација на референтната боја ROX според флуоресцентниот квантитативен термички циклер.Најсоодветните концентрации на референтна боја на ROX за обични квантитативни циклирачи со флуоресценција се прикажани во табелата подолу:

Табела 3-2: дадени се условите за реакција на qPCR

Забелешка: Со цел да се добие најдобар qPCR ефект, градиентната PCR може да се користи за оптимизирање на условите за реакција за различни шаблони и различни прајмери.Условите на реакцијата на PCR варираат во зависност од флуоресцентниот анализатор, шаблонот, прајмерот итн. Во специфичната операција, оптималните услови за реакција треба да се дизајнираат според специфичните услови на флуоресцентниот квантитативен термички циклер, типот на шаблонот, големината на фрагментот од интерес, основната секвенца на засилениот фрагмент и содржината на GC и должината на температурата на реакцијата, вклучително и времето на реакција, итн.

Принципи за дизајнирање на прајмер за PCR во реално време

Напреден прајмер и обратен прајмер

За Real Time PCR, дизајнот на прајмерот е многу важен.Прајмерите се поврзани со специфичноста и ефикасноста на засилувањето на PCR и може да се дизајнираат со повикување на следните принципи:

◆ Должина на прајмер: 18-30bp.

◆ содржина на GC: 40-60%.

◆ Tm вредност: Софтверот за дизајн на Primer, како што е Primer 5, може да ја даде вредноста Tm на прајмерот.Вредностите на Tm на прајмерите нагоре и низводно треба да бидат што е можно поблиску.Може да се користи и формулата за пресметка на Tm: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Кога се изведува PCR, како температура на жарење генерално се избира температура под вредноста на Tm на прајмерот од 5 °C (соодветното зголемување на температурата на жарење може да ја зголеми специфичноста на PCR реакцијата).

◆ Прајмери ​​и PCR производи:

◆ Должината на производот за засилување со PCR за дизајн на прајмер е по можност 100-150bp.

◆ Дизајнерските прајмери ​​во секундарната структура на шаблонот треба да се избегнуваат колку што е можно повеќе.

◆ Избегнувајте формирање на 2 или повеќе комплементарни основи помеѓу 3' краевите на спротиводно и низводно прајмери.

◆ Приклучната основа на прајмер 3' не може да биде присутна со 3 дополнителни последователни G или C.

◆ Самите прајмери ​​не можат да имаат комплементарни структури, инаку ќе се формира структура на фиба, што ќе влијае на засилувањето на PCR.

◆ ATCG треба да се дистрибуира што е можно подеднакво во прајмерната секвенца, а 3' терминалната основа треба да се избегнува како Т.

Додаток1:Cell ДиректенRT-qPCR Компонен за комплетт пакет со додатоци

1. Раствор за лиза на клетки