Стерилизација на врвови од пипети и EP цевки, итн.
1. Подгответе 0,1% (една илјадити) DEPC (високо токсична супстанција) со дејонизирана вода, користете ја внимателно во аспиратор и чувајте ја на 4°C подалеку од светлина;
Водата DEPC е чиста вода третирана со DEPC и стерилизирана со висока температура и висок притисок.Тестирано дека е без RNase, DNase и протеиназа.
2. Ставете го врвот на пипетата и EP цевката во 0,1% DEPC и проверете дали врвот на пипетата и EP цевката се наполнети со 0,1% DEP.
3. Заштитете од светлина, оставете да отстои преку ноќ (12-24 ч.)
4. Кутијата што ги содржи врвот и EP цевката не треба да се натопува во DEPC.Откако грубо ќе ја отстраните DEPC водата во врвот или EP цевката, пакувајте ја и завиткајте ја.
5. 121 степени Целзиусови, 30мин
6. 180 степени Целзиусови, суви неколку часа (најмалку 3 часа)
Забелешка: а.Носете латекс ракавици и маски кога ракувате со DEPC!б, или без DEPC стерилизација, 130 ℃, 90 мин автоклав (многу лаборатории стерилизација на висока температура двапати)
Размислувања за екстракција на РНК
Два главни феномени на неуспех на изолација на ткивна РНК
Деградација на РНК и остатоци од нечистотии во ткивата,во врска со деградацијата, ајде прво да погледнеме зошто РНК извлечена од култивирани клетки не се разградува лесно.Сите постојни реагенси за екстракција на РНК содржат компоненти кои брзо ја инхибираат RNase.Додадете го лизатот во култивираните клетки и едноставно измешајте го, сите клетки може темелно да се измешаат со лизатот, а клетките целосно да се лизираат.Откако клетките се лизираат, активните состојки во лизатот веднаш ја инхибираат интрацелуларната RNase, па РНК останува недопрена.Тоа е да се каже, бидејќи култивираните клетки лесно и целосно се контактираат со лизатот, нивната РНК не се разградува лесно;од друга страна, РНК во ткивото лесно се разградува бидејќи клетките во ткивото не се лесно да се контактираат брзо со лизатот.поради доволен контакт.Значи,под претпоставка дека постои начин да се претвори ткивото во една клетка додека се инхибира активноста на РНК, проблемот со деградација би можел целосно да се реши.
Мелењето со течен азот е најефективниот таков метод.Меѓутоа, методот на мелење со течен азот е многу проблематичен, особено кога бројот на примероци е голем.Ова доведе до следното најдобро нешто: хомогенизаторот.Нахомогенизаторметодот не го разгледува прашањето како активноста на RNase е инхибирана пред клетките да бидат контактирани со лизатот, туку се моли стапката на ткивно нарушување да биде побрза од брзината со која интрацелуларната RNase го разградува RN.
Ефектот на електричниот хомогенизатор е подобар,а ефектот на стаклениот хомогенизатор е слаб, но генерално, методот на хомогенизација не може да го спречи феноменот на деградација.Затоа, ако екстракцијата е деградирана, оригиналниот електричен хомогенизатор треба да се користи за мелење со течен азот;оригиналниот стаклен хомогенизатор треба да се смени во електричен хомогенизатор или директно да се меле со течен азот.Проблемот е речиси 100% изводлив.се реши.
Проблемот со остатоците од нечистотија што влијае на последователните експерименти има повеќе различни причини отколку деградација, а решенијата се соодветно различни.Во заклучок,ако има деградација или преостанати нечистотии во ткивото, методот/реагенсот на екстракција за конкретниот експериментален материјал мора да се оптимизира.Не мора да ги користите вашите скапоцени примероци за оптимизација: можете да купите некои мали животни како риба/пилешко од пазарот, да го земете соодветниот дел од материјалот за екстракција на РНК, а другиот дел за екстракција на протеини - мелете со екстракт од устата, желудникот и цревата.
Целната РНК на извлечената РНК се користи за различни последователни експерименти, а нејзините барања за квалитет се различни
Конструкцијата на библиотеката на cDNA бара интегритет на РНК без остатоци од инхибитори на ензимска реакција;Северна бара повисок интегритет на РНК и помали барања за остатоци од инхибитори на ензимска реакција;RT-PCR не бара премногу висок интегритет на РНК,но ги инхибира ензимските реакции.Барањата за остатоци се строги.Влезот го одредува излезот;секој пат кога целта е да се добие РНК со највисока чистота, тоа ќе ги чини луѓето и пари.
Собирање/Складирање на примероци
Фактори кои влијаат на деградацијата Откако примерокот ќе го напушти живото тело/или од првобитната средина за раст, ендогените ензими во примерокот ќе почнат да ја разградуваат РНК,а стапката на разградување е поврзана со содржината на ендогени ензими и температурата.Традиционално, постојат само два начини за целосно инхибирање на активноста на ендогени ензими: веднаш да се додаде лизатот и да се хомогенизира темелно и брзо;се сече на мали парчиња и веднаш се замрзнува во течен азот.И двата пристапи бараат брзо работење.Вториот е погоден за сите примероци, додека првиот е погоден само за ткива со мала содржина на клетки и ендогени ензими и полесни за хомогенизација.Поточно, растителното ткиво, црниот дроб, тимусот, панкреасот, слезината, мозокот, масното ткиво, мускулното ткиво итн. најдобро е да се замрзнат со течен азот пред да се продолжи.
Фрагментација и хомогенизација на примероците
Фактори кои влијаат на деградација и принос Фрагментацијата на примерокот еза темелна хомогенизација, што е за целосно и целосно ослободување на РНК.Клетките може директно да се хомогенизираат без да се скршат.Ткивата може да се хомогенизираат само откако ќе се скршат.Квасецот и бактериите треба да се скршат со соодветни ензими пред да се хомогенизираат.Ткивата со помала содржина на ендогени ензими и полесна хомогенизација може да се дробат и хомогенизираат едно време во лизатот со помош на хомогенизатор;растително ткиво, црн дроб, тимус, панкреас, слезина, мозок, масно ткиво, мускулно ткиво и други примероци, или се богати со ендогени ензими или не се лесно хомогенизирани,па ткивното нарушување и хомогенизација мора да се вршат посебно.Најсигурен и најпродуктивен метод на фрагментација е мелењето со течен азот, а најсигурен метод за хомогенизација е употребата на електричен хомогенизатор.Посебна забелешка за мелењето со течен азот: примерокот не смее да се одмрзнува во текот на целиот процес на мелење, бидејќи ендогените ензими имаат поголема веројатност да функционираат при замрзнување.
Избор на лизат
Влијае на практичноста на работењето и факторите на резидуални ендогени нечистотии Најчесто користените раствори за лиза речиси можат да ја инхибираат активноста на RNase.Затоа, клучната точка при изборот на раствор за лиза е да се земе предвид во комбинација со методот на прочистување.Има еден исклучок:примероците со висока содржина на ендогени ензими се препорачуваат да користат лизат што содржи фенол за да се зголеми способноста за деактивирање на ендогени ензими.
Избор на метод на прочистување
Фактори кои влијаат на резидуалните ендогени нечистотии, брзина на екстракција За чисти примероци како што се клетките, може да се добијат задоволителни резултати со речиси секој метод на прочистување при рака.Но, за многу други примероци, особено оние со високо ниво на нечистотии како што се растенија, црн дроб, бактерии итн., изборот на соодветен метод за прочистување е од клучно значење.Методот на центрифугално прочистување со колона има брза брзина на екстракција и може ефикасно да ги отстрани нечистотиите кои влијаат на последователната ензимска реакција на РНК, но е скап (Foregene може да понуди рентабилни комплети, повеќе детали кликнетеовде);со користење на економични и класични методи на прочистување, како што е врнежите со LiCl, исто така може да се добијат задоволителни резултати, но времето на работа е долго..
„Три дисциплини и осум внимание“ за екстракција на РНК
Дисциплина 1:Стави крај на контаминацијата на егзогените ензими.
Забелешка 1:Строго носете маски и ракавици.
Забелешка 2:Цевките за центрифуга, главите на врвовите, шипките за пипети, резервоарите за електрофореза и експерименталните клупи вклучени во експериментот треба темелно да се отстранат.
Забелешка 3:Реагенсите/растворите вклучени во експериментот, особено водата, мора да бидат без RNase.
Дисциплина 2:Блокирајте ја активноста на ендогени ензими
Забелешка 4:Изберете соодветен метод на хомогенизација.
Забелешка 5:Изберете соодветен лизат.
Забелешка 6:Контролирајте ја почетната количина на примерокот.
Дисциплина 3:Разјаснете ја вашата цел за екстракција
Забелешка 7:Со секој систем за лиза што се приближува до максималната почетна количина на примерок, стапката на успех на екстракција нагло опаѓа.
Забелешка 8:Единствениот економски критериум за успешна екстракција на РНК е успехот во последователните експерименти, а не приносот.
Топ 10 извори на контаминација со RNase
1. Прстите се првиот извор на егзогени ензими, па затоа мора често да се носат и менуваат ракавици.Покрај тоа, мора да се носат и маски, бидејќи дишењето е исто така важен извор на ензими.Дополнителна придобивка од носењето маска за ракавици е да се заштити експериментаторот.
2. Врвови за пипети, цевки за центрифугирање, пипети – RNase не може да се деактивира само со стерилизација, затоа врвовите на пипетите и цевките за центрифуга треба да се третираат со DEPC, дури и ако се означени како третирани со DEPC.Најдобро е да користите пипета за специјална намена, избришете ја со памук од 75% алкохол пред употреба, особено шипката;освен тоа, внимавајте да не користите средство за отстранување на главата.
3. Водата/тампонот мора да биде без контаминација со RNase.
4. Барем масата за тестирање треба да се избрише со 75% алкохолни памучни топчиња.
5. Ендогена RNase Сите ткива содржат ендогени ензими, така што брзото замрзнување на ткивата со течен азот е најдобриот начин за намалување на деградацијата.Методот за складирање/мелење на течен азот е навистина незгоден, но тоа е единствениот начин за ткива со високо ниво на ендогени ензими.
6. Примероци на РНК Производите за екстракција на РНК може да содржат траги од контаминација со RNase.
7. Екстракција на плазмид Екстракцијата на плазмидата често користи Rnase за разградување на РНК, а резидуалната Rnase треба да се вари со протеиназа К и да се екстрахира со PCI.
8. Складирање на РНК Дури и ако се складира на ниска температура, трагите на RNase ќе предизвикаат деградација на РНК.Најдоброто решение за долгорочно зачувување на РНК е суспензијата на сол/алкохол, бидејќи алкохолот ја инхибира целата ензимска активност при ниски температури.
9. Кога катјоните (Ca, Mg) ги содржат овие јони, загревањето на 80C за 5 минути ќе предизвика расцепување на РНК, па ако треба да се загрее РНК, растворот за конзервација треба да содржи хелатен агенс (1 mM Натриум цитрат, pH 6,4).
10. Ензимите кои се користат во следните експерименти може да бидат контаминирани со RNase.
10 Совети за екстракција на РНК
1: Брзо спречете ја активноста на RNase.Примероците брзо се замрзнуваат по собирањето, а RNase се деактивира со брза операција за време на лизата.
2: Изберете соодветен метод на екстракција за ткиво со висока содржина на рибозим, а масното ткиво најдобро е да се користи методот што содржи фенол.
3: Квалитетот на предвидување бара Северна, конструкцијата на библиотеката cDNA бара висок интегритет, а RT-PCR и RPA (рибонуклеаза заштитна анализа) не бараат висок интегритет.RT-PCR бара висока чистота (остатоци од ензимски инхибитори).
4: Темелната хомогенизација е клучот за подобрување на приносот и намалување на деградацијата.
5: Проверете го интегритетот на детекцијата на електрофореза на РНК, 28S: 18S = 2: 1 е целосен знак, 1: 1 е исто така прифатливо за повеќето експерименти.
6: Отстранување на ДНК за RT-PCR, анализа на низа Најдобро е да се користи Dnase I за отстранување на ДНК.
7: Намалете ја контаминацијата на егзогените ензими - ензимите не можат да се увезуваат однадвор.
8: Кога се концентрира нуклеинска киселина со ниска концентрација, треба да се додаде реагенс за истовремена таложење.Но, за да се спречи ко-преципитантот кој содржи ензими и контаминација на ДНК.
9: Темелно растворете ја РНК, доколку е потребно, загревајте на 65C 5 минути.
соодветен начин на складирање
Може да се чува на -20C кратко време и на -80C долго време.Првиот чекор во подобрувањето на приносите на РНК е да се сфати дека содржината на РНК во различни примероци многу варира.Високо изобилство (2-4 mg/mg) како што се црниот дроб, панкреасот, срцето, средното изобилство (0,05-2 mg/mg) како што се мозокот, ембрионот, бубрезите, белите дробови, тимусот, јајниците, ниското изобилство (<0,05 mg/mg) mg) како што се мочниот меур, коските, мастите.
1: Лизирајте клетки за ослободување на RN - ако РНК не се ослободи, приносот ќе се намали.Електричната хомогенизација функционира подобро од другите методи на хомогенизација, но можеби ќе треба да се комбинира и со други методи, како што се матење со течен азот, ензимско варење (лизозим/литиказа)
2: Оптимизација на методот на екстракција.Најголемите проблеми со методите базирани на фенол се нецелосната стратификација и делумното губење на РНК (супернатантот не може целосно да се отстрани).Нецелосната стратификација се должи на високата содржина на нуклеинска киселина и протеини, што може да се реши со зголемување на количината на користен лизат или со намалување на количината на примерок.Во масното ткиво е додаден чекор на екстракција на хлороформ.Губењето на РНК може да се намали со повратно пумпање или со отстранување на органскиот слој проследено со центрифугирање.Најголемиот проблем со методите засновани на центрифугирање со колона е вишокот примерок.
Класични совети за екстракција
1. Прочистување на фенол: Додадете еднаков волумен од 1:1 фенол/хлороформ и енергично измешајте 1-2 минути.Центрифугирајте со голема брзина 2 минути.Внимателно отстранете го супернатантот (80-90%).Никогаш не доаѓајте до средниот слој.Еднаков волумен од реакциониот раствор може да се додаде во фенол/хлороформ и да се отстрани супернатантот.Двата супернатанта може да се мешаат заедно за таложење на нуклеинска киселина за да се подобри приносот.Не бидете премногу нежни при мешањето и не обидувајте се да го отстраните целиот супернатант.
2. Перење со 70-80% етанол: За време на миењето, нуклеинската киселина мора да се суспендира за да се осигура дека преостанатата сол е измиена.Во исто време, веднаш по истурањето на етанолот, центрифугирајте со голема брзина неколку секунди, а потоа отстранете го преостанатиот етанол со пипета.Се раствора откако ќе отстои на собна температура 5-10 минути.
11. Извлекување на специјални организации
1. Фиброзно ткиво: Клучот за екстракција на РНК од фиброзно ткиво како што е срцето/скелетниот мускул е целосно да се наруши ткивото.Овие ткива имаат мала клеточна густина, така што количината на РНК по единица тежина на ткивото е мала, и најдобро е да се користи што е можно повеќе почетна количина.Погрижете се темелно да го мелете ткивото под услови на замрзнување.
2. Ткива со висока содржина на протеини/масти: содржината на мозочни/растителни масти е висока.По екстракција на PCI, супернатантот содржи бели флокули.Супернатантот мора повторно да се екстрахира со хлороформ.
3. Ткива со висока содржина на нуклеинска киселина/рибозим: слезината/тимусот има висока содржина на нуклеинска киселина и рибозим.Мелењето ткиво во услови на замрзнување проследено со брза хомогенизација може ефикасно да ги деактивира рибозимите.Меѓутоа, ако лизатот е премногу вискозен (поради високата содржина на нуклеинска киселина), екстракцијата на PCI нема да може ефективно да се раслојува;Додавањето повеќе лизат може да го реши овој проблем.Повеќекратните екстракции на PCI можат да отстранат повеќе резидуална ДНК.Ако веднаш по додавањето алкохол се формира бел талог, тоа укажува на контаминација на ДНК.Повторната екстракција со кисела PCI по растворање може да ја отстрани контаминацијата на ДНК.
4. Растително ткиво: Растителното ткиво е покомплексно од животинското ткиво.Општо земено, растенијата се мелат во услови на течен азот, така што деградацијата на РНК од ендогени ензими е невообичаена.Ако проблемот со деградацијата не е решен, речиси сигурно е предизвикан од нечистотии содржани во примерокот.Нечистотиите содржани во многу растенија ќе доведат до остатоци, а причината за остатоците често е затоа што овие нечистотии имаат некои сличности со РНК: вие таложите и јас таложам, а вие адсорбирате и јас адсорбирам.Овие карактеристики одредуваат дека тие се многу силни ензимски инхибитори.
Во моментов, комерцијалните реагенси за екстракција на РНК можат да се прилагодат на речиси сите животински ткива со мали прилагодувања, но има неколку комерцијални реагенси за екстракција на РНК кои можат да бидат погодни за повеќето растителни ткива.За среќа, Foregene може да обезбеди посебникомплети за екстракција на РНК на растенијата, ние имамеКомплет за изолација на тотална РНК на растенијата, Комплет за изолација на тотална РНК на растенијата Плус.Вториот е специјално дизајниран за растенија со висока содржина на полисахариди и полифеноли.За екстракција на РНК, повратните информации од лабораториските корисници се особено добри.
12. Ефект од замрзнување и одмрзнување на примерокот Замрзнатиот примерок може да биде поголем и треба да се исече пред да се користи за екстракција на РНК.Примероците имаат тенденција да се топат (можеби делумно) за време на сечењето.Замрзнатите примероци можеби ќе треба да се измерат пред екстракција на РНК, а одмрзнувањето дефинитивно ќе се случи во текот на овој процес.Понекогаш, одмрзнувањето на примерокот се случува и за време на процесот на мелење со течен азот;или замрзнатиот примерок директно се додава во лизатот без мелење со течен азот и дефинитивно ќе дојде до одмрзнување пред целосната хомогенизација.Експериментите покажаа дека замрзнатото ткиво е повеќе склоно кон деградација на РНК за време на одмрзнувањето отколку свежото ткиво.Веројатната причина: Процесот на замрзнување-одмрзнување ги нарушува структурите во клетката, што им олеснува на ендогените ензими да дојдат во директен контакт со РНК.
13. Проценка на квалитетот на РНК Обично, електрофорезата се користи за да се процени интегритетот на РНК, а А260/А280 се користи за да се процени чистотата на РНК.Теоретски, недопрената РНК има сооднос 28S:18S = 2,7:1, а повеќето податоци го нагласуваат односот 28S:18S = 2:1.Факт е дека речиси ниту една РНК извлечена од примероци освен клетките не е во сооднос 2:1 (ова е добиено со помош на Agilent Bioanalyzer).
Резултатите од електрофорезата на РНК се под влијание на многу фактори, вклучително и секундарна структура, услови на електрофореза, оптоварување на примерокот, степен на заситеност од EB, итн. Користете народна електрофореза за откривање на РНК и користете ДНК маркер како контрола.Ако 28S на 2kb и 18S на 0,9kb се јасни, а 28S: 18S > 1, интегритетот може да ги исполни барањата на повеќето последователни експерименти.
A260/A280 е индикатор што предизвика многу конфузија.Пред сè, неопходно е да се разјасни оригиналното значење на овој индикатор за нуклеинските киселини: чиста РНК, нејзината A260/280 = околу 2,0.Чистата РНК е „причината“, а A260/A280 = 2 е „ефектот“.Сега сите го користат A260/A280 како „причина“, мислејќи дека „ако A260/A280 = 2, тогаш РНК е чиста“, што природно води до конфузија.
Ако сте заинтересирани, можете да додадете малку реагенс што често се користи во екстракцијата, како што се фенол, гванидин изотиоцијанат, PEG, итн., на вашиот примерок од РНК, а потоа да го измерите односот A260/A280.Реалноста е дека многу од реагенсите што се користат за екстракција на РНК, како и многу нечистотии во примерокот, апсорбираат околу A260 и A280, што влијае на A260/A280.
Најпоучен пристап во моментов е скенирање на примероци од РНК во опсег од 200-300 nm.Кривата на чиста РНК ги има следните карактеристики: кривата е мазна, A230 и A260 се две точки на флексија, A300 е блиску до 0, A260/A280 = околу 2,0 и A260/A230 = околу 2,0.Ако податоците од скенирањето не се достапни, мора да се одреди и односот A260/A230, бидејќи овој сооднос е почувствителен на пренесување на сите нечистотии кои влијаат на ензимската реакција.Земете го предвид линеарниот опсег на уредот (0,1–0,5 за A260).
Постојат два други корисни феномени: односот ќе биде околу 0,3 помал кога A260/A280 се мери во вода;додека односот измерен во 10 mM EDTA е околу 0,2 повисок од оној измерен во 1 mM EDTA.
Поврзани производи:
Производител и добавувач на комплет за изолација на фабрика за РНК во Кина |Foregene (foreivd.com)
Серија за изолација на РНК - Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)
Време на објавување: 15 јули 2022 година
