Експериментот RT-qPCR вклучува екстракција на РНК и проценка на квалитетот, обратна транскрипција и qPCR три чекори, секој чекор има многу мерки на претпазливост, ќе воведеме детално подолу.

Ⅰ.Проценка на квалитетот на РНК

Во експериментот RT-qPCR, по завршувањето на екстракцијата на РНК, треба да се оцени квалитетот на РНК, а последователниот експеримент може да се спроведе само откако ќе се квалификува.Методите на евалуација вклучуваат спектрофотометар, Agilent гел електрофореза, Agilent 2100 анализа, меѓу кои најчесто користениот спектрофотометар и методот на електрофореза со агарозен гел за откривање.Треба да се напомене дека овие два методи треба да се користат заедно за да се заврши откривањето и анализата на концентрацијата, чистотата и интегритетот на РНК, за да се обезбеди квалитетот на РНК.

Поврзан комплет за изолација на РНК: 

Комплет за изолација на тотална РНК на клетките

Високо прочистена и висококвалитетна вкупна РНК може да се добие од различни култивирани клетки за 11 мин.

Комплет за изолација на тотална РНК на животните

Брзо и ефикасно извлекување на вкупна РНК со висока чистота и висок квалитет од различни животински ткива.

Спектрофотометар:

Спектрофотометарот главно се користи за одредување на концентрацијата и чистотата на РНК, но не може да го открие интегритетот на РНК и геномскиот остаток.Меѓу нив, A260/280 и A260/230 се важни параметри за откривање на чистотата на РНК, а чистотата на РНК може да се открие според флуктуацијата на нивните вредности:

1. 1.9< A260/280< 2.1, што покажува дека чистотата на РНК е добра;A260/280<1.9, што покажува дека може да има протеински остаток во РНК;A260/280>2.1, што укажува на можна делумна деградација на РНК, што може дополнително да се потврди со електрофореза со гел агароза.

2. 2.0< A260/230< 2.2, што покажува дека чистотата на РНК е добра;A260/230< 2.0, што покажува дека може да има остатоци од органски реагенси во РНК, како што се феноли, етанол или шеќери.

Електрофореза со гел агароза:

Анализата за електрофореза на гел агароза може да го анализира интегритетот на РНК, геномот и протеинските остатоци, но не може точно да ја квантифицира концентрацијата на РНК или да открие остатоци од органски реагенси.Земете шаблони за еукариотска РНК на пример:

1. РНК беше подложена на електрофореза со гел агароза.Ако имало само три единечни ленти на 28sRNA, 18sRNA и 5.8sRNA на картата на гелот, тоа покажува дека извлечената РНК е недопрена.Ако има феномен на влечење, тоа укажува на делумна деградација на РНК.

2. Ако постои една светла лента помеѓу дупката за лепак и лентата 28sRNA, може да има геномски остаток на ДНК.

3. Ако се појават ленти во дупката за лепило, тоа покажува дека може да има остатоци од протеини и други макромолекуларни супстанции.

Ⅱ. Обратна транскрипција

По завршувањето на екстракцијата на РНК, таа треба да се врати во cDNA за последователни експерименти, така што чекорот на враќање е од суштинско значење.Обратна транскрипција ќе биде воведена од изборот на реверзна транскриптаза и прајмер:

Избор на обратна транскриптаза:

Типичните реверзни транскриптази вклучуваат AMV RTase и MMLV RTase.RNase H на AMV RTase има силна активност, кратка должина на синтеза, мала количина на синтеза и добра термичка стабилност (42 ~ 55 ℃).Активноста на RNase H на MMLV RTase е слаба, должината на синтезата е долга, количината на синтеза е висока и термичката стабилност е слаба (37 ~ 42 ℃).

Бидејќи ензимот RNase H има функција на деградирање на РНК шаблон, MMLV со слаба активност на RNase H треба да биде преференцијално избран при обратна транскрипција, а по подоцнежното генетско инженерство, термичката стабилност на MMLV достигна квалитативен скок.Земање ForegeneForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV за обратна транскрипција) како пример, тоа е нова реверзна транскриптаза изразена во E. coli инженерски бактерии користејќи технологија на генетска рекомбинација.Тоа е рекомбинантна ДНК полимераза која синтетизира комплементарна ДНК влакно од едноверижна РНК, ДНК или хибрид РНК:ДНК.Нема активност на RNase H, силна стабилност, силен афинитет на РНК и висока чувствителност на детекција.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV за обратна транскрипција)

Избор на прајмер:

Генерално RT прајмерите спаѓаат во три категории: олиго dT, случајни прајмери ​​и генски специфични прајмери.Изберете соодветни прајмери ​​за употреба според различни експериментални барања.

1. Ако шаблонот е од еукариотско потекло и доцната cDNA се користи за рутинско PCR засилување, се препорачува Oligo (dT);Ако последователниот експеримент се користи само за qPCR, Oligo (dT) се препорачува да се меша со случајни прајмери ​​за да се подобри ефикасноста на обратната транскрипција.

2. Ако шаблонот е од прокариоти, треба да се изберат случајни прајмери ​​или генски специфични прајмери ​​за обратна транскрипција.

Ⅲ.qPCR

Квантификацијата на флуоресценција главно е елаборирана од изборот на квантитативни методи, принципите на дизајнирање на прајмерот, изборот на ROX, конфигурацијата на системот за реакција и поставувањето на условите за реакција итн.

Избор на квантитативни методи:

Квантитативните методи се поделени на релативни квантитативни методи и апсолутни квантитативни методи.Релативната квантификација може да се користи за да се открие ефектот на одредени методи на третман врз генската експресија, да се открие разликата во генската експресија во различни времиња и да се спореди разликата во генската експресија во различни ткива.Апсолутна квантификација може да го открие количеството на нуклеинска киселина во вирусот и така натаму.Кога правиме експерименти, ние мора да ги избереме соодветните квантитативни методи според нашите сопствени експерименти.

Принципи за дизајн на прајмер:

Дизајнот на прајмер за qPCR е директно поврзан со ефикасноста на засилување и специфичноста на производот.Затоа, правилното дизајнирање на добри прајмери ​​е првиот чекор за успешна qPCR.При дизајнирање на прајмер, треба да се обрне внимание на следниве принципи при исполнување на принципот на конвенционален дизајн на прајмер:

1. Должината на целниот фрагмент се контролира помеѓу 100 и 300 bp;

2. Дизајн на вкрстени егзони за да се избегне влијанието на геномската ДНК;

3. Дизајнираните прајмери ​​треба да се тестираат за ефикасност на засилување и само кога ефикасноста на засилување ќе го достигне стандардот (90-110%) може да се користат за квантитативни експерименти;

4. Концентрацијата на прајмер обично се оптимизира помеѓу 0,1uM и 1,0uM.

Избор наROX:

Во процесот на квантитативна реакција, ROX може рамномерно да ја прилагоди разликата во оптичката патека, грешката во пипетирањето или разликата во волуменот предизвикана од испарување и кондензација, подобрувајќи ја повторливоста на резултатите.Сепак, треба да се напомене дека изборот на ROX е поврзан со инструментот.Ако qPCR инструментот има функција за автоматска корекција на разликата помеѓу дупките, не треба да додава ROX;во спротивно, треба да додаде ROX корекција.Малите партнери при купувањето реагенси мора да бидат според инструментот што се користи за да се избере точниот ROX, избегнувајте подоцнежни грешки.

Подготовка на систем за реакција:

Се претпочитаат волумени на реакција од 20 ul и 50 ul.Кога се формулира системот, треба да се обрне внимание на следниве работи:

1. Системот за реакција треба да се подготви со вентилација во ултра чиста работна маса, нов ddH₂О се користи за секој експеримент;

2. Секој експеримент треба да подготви NTC за да потврди дали има загадување во системот и секој пар прајмери ​​треба да направи NTC при подготовка на системот;

3. За да се открие дали има остатоци од gDNA во шаблонот на РНК, NRT може да се подготви за секој примерок за детекција;

4. При подготовка на системот, се препорачува да се направат најмалку 3 технички повторувања за еден примерок;

5. Кога шаблонот е cDNA, се препорачува да се разреди 5-10 пати за да се намали ефектот на инхибиција на системот за обратна транскрипција на qPCR експериментот.Подобро е да се истражи количината на шаблонот по градиент, така што вредноста на КТ паѓа помеѓу 20-30;

6. Одредете го потребниот број на реакции, зголемете за 5-10% врз основа на бројот на реакции и пресметајте го бројот на конфигурацијата на волуменот;

7, системот е подготвен со користење на принципот на премикс, мешајќи се по центрифугирањето и обезбедува без меурчиња;

8, колку што е можно да се избере поддршка потрошен материјал.

Поврзан комплет RT-qPCR