Специфичност на откривање

Во повеќето случаи, целта на дизајнот на прајмерот е да се максимизира специфичноста на PCR.Ова се одредува со повеќе или помалку предвидливо влијание на многу променливи.Една важна променлива е низата на 3'крајот од прајмерот.

Поважно, PCR анализите дизајнирани за специфичност имаат поголема веројатност да одржуваат висока ефикасност во широк динамички опсег, бидејќи анализата не произведува неспецифични производи за засилување, со што се натпреварува со PCR реагенси или ја инхибира главната реакција на засилување.

Се разбира, во некои случаи, специфичноста не е најважна, на пример, кога целта е да се квантифицираат тесно поврзани, но различни патогени, потребни се посебни стандарди за дизајн, оптимизација и верификација.

Кривата на топење е стандарден метод за проценка на специфичноста на ампликоните, барем во однос на тоа дали да се засили една цел.Сепак, мора да се нагласи дека кривите на топење можат да бидат погрешни бидејќи, на пример, може да бидат засегнати од комбинираните ефекти на неоптималните прајмери ​​и ниските концентрации на шаблонот.

P5 |Кривата на топење ги покажува Tm поместувањата добиени од две детекции на различни количини на две целни ДНК.

А. При повисоки концентрации (ад)), нема очигледен прајмер димер откако ќе заврши мерењето на qPCR.Како што концентрацијата на шаблонот се намалува на 50 копии (д), почнува да се појавува неспецифичен производ и станува единствениот производ со најниска концентрација (f).

Б. Тестот го забележа истиот Tms на сите целни концентрации и немаше очигледен димер на прајмер дури и при најниска концентрација (5 копии).При користење на овие два методи за откривање, не беа откриени производи за засилување во NTC.

P5 ги прикажува кривите на растворање добиени со примероци во кои шаблонот е присутен во различни концентрации.P 5a покажува дека при двете најниски концентрации, Tms на произведените неспецифични производи за засилување се пониски од оние на специфичните ампликони.

Очигледно, овој метод на откривање не може со сигурност да се користи за откривање цели кои постојат во ниски концентрации.

Интересно, NTCs, т.е. примероци без воопшто ДНК, не забележаа (неспецифични) производи за амплификација, што покажува дека позадинската геномска ДНК може да учествува во неспецифично засилување/полимеризација.

Понекогаш таквите прајмери ​​за позадина и неспецифичното засилување не можат да се поправат, но често е можно да се дизајнира метод за откривање што нема неспецифично засилување во која било концентрација на шаблон и NTC (P 5b).

Овде, дури и снимањето на засилување на целната концентрација со Cq од 35 ќе произведе специфична крива на растворање.Слично на тоа, NTC не покажале знаци на неспецифично засилување.Понекогаш, однесувањето на детекцијата може да зависи од мајчиниот пијалак и само неспецифично засилување се открива во одредени пуферски состави, кои може да бидат поврзани со различни концентрации на Mg2+.

Стабилност на откривање

Оптимизацијата на Ta е корисен чекор во процесот на емпириска верификација и оптимизација на qPCR детекцијата.Обезбедува директна индикација за робусноста на поставената прајмер со прикажување на температурата (или температурниот опсег) што произведува најнизок Cq без засилување на NTC.

Разликата од два до четири пати во чувствителноста можеби не е важна за луѓето со висока експресија на mRNA, но за дијагностички тестови, тоа може да значи разлика помеѓу позитивни и лажно негативни резултати.

Ta својствата на qPCR прајмерите може многу да се разликуваат.Некои тестови не се многу робусни и ако не се изведат под оптималната Та вредност на прајмерите, тие брзо ќе пропаднат.

Ова е важно бидејќи овој тип на откривање често е проблематичен во реалниот свет, а чистотата на примерокот, концентрацијата на ДНК или присуството на друга ДНК можеби не се оптимални.

Дополнително, бројот на целната копија може да варира во широк опсег, а реагенсите, пластичните прибори или инструментите може да се разликуваат од оние што се користат при поставување на тестот.

P6|Температивниот градиент ја покажува различната робусност на PCR детекцијата.

A. Користете го Bioline's Sensifast SYBR mastermix (каталог број BIO-98050) за да извршите PCR на cDNA подготвена од РНК на човечки мозок.

B. Користете го Bio-Rad's CFX qPCR инструмент за снимање на мапата на засилување и кривата на растворање на апален (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).

В. График на засилување и крива на топење на ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).

Г. График на засилување и крива на растворање на GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCTCTCGTGGATCTTC).

E. Cqs снимени на различни температури на жарење, покажувајќи ја разликата во Cq снимен под температурен градиент од 7C.

P 6 покажува типичен резултат на непожелен тест, каде што qPCR беше изведен со користење на градиент Tas помеѓу 59C и 67C (P 6a), користејќи прајмери ​​за три гени специфични за човечкиот мозок.

Може да се види од графикот за засилување дека Opalin прајмерите се далеку од идеални бидејќи нивниот оптимален Ta опсег е многу тесен (Слика 6б), односно Cqs се широко дисперзирани, што резултира со Cqs значително да се споредуваат со нивните оптимални Cqs Low.

Овој метод на откривање е нестабилен и може да доведе до неоптимално засилување.Затоа, овој пар на прајмери ​​треба да се редизајнира.Дополнително, анализата на кривата на топење (внесување) покажува дека специфичноста на овој метод на откривање исто така може да биде проблематична, бидејќи кривата на топење на секој Та е различна.

Методот за откривање ACSBG1 прикажан во P 6c е поробустен од методот за откривање Opalin погоре, но сепак е далеку од идеален и веројатно е дека може да се подобри.

Сепак, нагласуваме дека не постои неопходна врска помеѓу робусноста и специфичноста, бидејќи кривата на растворање произведена со овој метод на откривање ја покажува истата врвна вредност во сите Tas (внесени).

Од друга страна, тестот за робусност е многу потолерантен, создавајќи слични Cqs во широк опсег на Tas, како во тестот GFAP прикажан во P 6d.

Разликата во Cqs добиена во истиот опсег од 8 степени Целзиусови е помала од 1, а кривата на растворање (внесена) ги потврдува карактеристиките на откривање во овој температурен опсег.Вреди да се напомене дека пресметаниот Tas и вистинскиот опсег Ta може да бидат многу различни.

Постојат многу упатства дизајнирани да им помогнат на истражувачите да дизајнираат ефикасни прајмери, од кои повеќето се засноваат на одамна воспоставени правила и многу внимание е посветено на 3'крајот на прајмерите.Често се препорачува да се вклучат G или C на 3' крајот и две G или C бази (GC стегач), но не повеќе од две од последните 5 основи.

Во пракса, овие правила можат да ги водат истражувачите, но тие не се нужно точни под сите околности.

P7 |3'крајот на прајмерот има мало влијание врз специфичноста или ефикасноста.

A. Позицијата на прајмерите за човечкиот HIF-1α (NM_181054.2) ген.

B. Користете Agilent Brilliant III SYBR Green мајчин пијалок (Кат. бр. 600882) за засилување на шест тест ставки.

В. График на засилување и крива на топење снимени со инструментот CFX qPCR на Bio-Rad и 3'крајните прајмери.NTC се прикажани со црвено.

D. Cqs евиденција за секој тест ставка

На пример, резултатот во P 7 е во спротивност со правилото 3'крај.Сите дизајни даваат во основа исти резултати, со само две комбинации на прајмери ​​кои водат до неспецифично засилување во NTC.

Сепак, не можеме да го поддржиме ефектот на GC клипот, бидејќи во овој случај, користењето на A или T како максимум 30 бази не ја намалува специфичноста.

Тестот C, каде што прајмерот F завршува на GGCC, сними Cqs во NTC, што покажува дека некој би можел да сака да ги избегне овие секвенци на 30-крајот.Нагласуваме дека единствениот начин да се одреди најдобрата 3'крајна секвенца на пар буквар е експериментално да се процени некои кандидатски прајмери.

Ефикасност на засилување

Поважно е, иако неспецифичното PCR детекција никогаш не може да стане специфично, ефикасноста на засилување може да се прилагоди и максимизира на многу различни начини со менување на ензимот, мајчиниот алкохол, адитивите и условите за циклус.

За да се оцени ефикасноста на PCR детекцијата, најдобро е да се користи сериско разредување од 10 или 5 пати повеќе од целната нуклеинска киселина, односно „стандарден метод на крива“.

Ако PCR ампликони или синтетички цели на ДНК се користат за генерирање стандардна крива, сериските разредувања на овие цели треба да се мешаат со константна количина на позадинска ДНК (како што е геномската ДНК).

P8 |Крива на разредување за да се оцени ефикасноста на PCR.

A. Користете прајмери ​​за HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA и R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC и Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (каталог број 600882) за PCR и услови на кривата на топење.

Б. 100 ng РНК беше обратно транскрибирана, разредена 2 пати, а сериски разредените примероци на cDNA беа разредени 5 пати до 1 ng човечка геномска ДНК.Кривата на топење е прикажана во влошката.

C. Реакцијата RT, разредувањето и сериското разредување беа повторени за вториот примерок на cDNA, а резултатите беа слични.

P 8 покажува две стандардни криви, користејќи ист метод за откривање на два различни примероци на cDNA, резултатот е иста ефикасност, околу 100%, а вредноста на R2 е исто така слична, односно степенот на вклопување помеѓу експерименталните податоци и линијата на регресија или податочниот Степен на линеарност.

Двете стандардни криви се споредливи, но не сосема исти.Ако целта е точно да се измери целта, мора да се забележи дека е неприфатливо да се обезбеди пресметка на бројот на копијата без да се објасни неизвесноста

P9 |Мерната несигурност поврзана со квантификација користејќи стандардна крива.

A. Користете прајмери ​​за GAPDH (NM_002046) за да извршите PCR и услови на кривата на топење.F: ACAGTTGCCATGTAGACC и R: TAACTGGTTGAGCACAGG и мастермикс на Bioline's Sensifast SYBR (каталог број BIO-98050).

Б. Табела за засилување, крива на топење и стандардна крива снимени со инструментот CFX qPCR на Bio-Rad.

В. График на стандардна крива и 95% интервал на доверба (CI).

Г. Бројот на копијата и 95% интервал на доверливост на трите вредности на Cq добиени од кривата на разредување.

P 9 покажува дека за оптимизиран тест, инхерентната варијабилност на една стандардна крива е приближно 2 пати (95% интервал на доверба, минимум до максимум), што може да биде најмалата варијабилност што може да се очекува.

Поврзан производ:

Cell Direct RT qPCR комплет

Комплет за директно PCR за опашка на глувчето

Комплет за директно PCR за животинско ткиво