RNase е чувствителен збор што многу студенти кои често спроведуваат експерименти за екстракција на РНК не сакаат да го слушнат.Целосно вооружена, РНК која конечно беше извлечена со високотоксични реагенси фенол и хлороформ беше деградирана.Не сум помирен!!!Денес, да го погледнеме потеклото на познатиот Рнасе.

Рибонуклеаза (RNase), или RNase, е нуклеаза која може да ја хидролизира РНК во мали молекули.RNase, како протеин со мала молекула, е невообичаено стабилна .Конвенционалната стерилизација на пареа со висока температура и висок притисок и инхибитори на протеини не можат целосно да ја инактивираат.Стабилноста на RNase главно доаѓа од дисулфидните врски во структурата.На пример, најчесто користената RNase на говедскиот панкреас има само 124 амино киселини, но содржи 4 дисулфидни врски.Сулфурната врска и дисулфидната врска и даваат на RNase одлична термичка стабилност.Покрај тоа, rnase има релативно мала молекуларна тежина и може брзо да ја врати својата првобитна конформација во многу случаи.

Покрај тоа што е исклучително стабилен,RNases се сеприсутни во лабораторијата .RNase е биолошки одбранбен механизам.За клетка, егзогената РНК често е фатална.Во споредба со егзогената ДНК, егзогената РНК е често поопасна.РНК е среќно транскрибирана и преведена, така што скоро сите организми еволуирале RNase за да се одбранат од инвазијата на егзогена РНК.Затоа, бактериските клетки култивирани во лабораторија и вие што ја извлекувате РНК зрачите со арома на RNase.Човечките телесни течности (плунка, солзи, итн.) содржат голема количина на RNase, затоа не плачете кога РНК се разградува.Колку повеќе плачете, толку е полошо деградацијата на РНК!!Сестрата Даију не е погодна за екстракција на РНК!

Покрај тоа, вашата нежна кожа содржи и многу RNase, а маркерите, пипетите, вратите на фрижидерот и рачките на вратите што ги допрела кожата исто така содржат RNase.

Со толку многу шетање, ајде да погледнеме како да се справиме со RNases.

Првото нешто на што помислуваат сите при отстранување на РНК еDEPC(диетил пирокарбонат).DEPC главно го денатурира протеинот со комбинирање со прстенот на имидазол на активната група RNase хистидин, а со тоа ја инхибира активноста на ензимот.0,1% DEPC може да има подобар ефект на отстранување на Rnase, но треба да обрнеме внимание дека DEPC е познат канцероген, па затоа треба да се посвети посебно внимание при неговото користење.

За RNase, треба да почнеме од два аспекти,првиот е да ја инхибира активноста на ендогената RNase

Конвенционалните реагенси за екстракција на РНК како што се гванидин изотиоцијанат и ДТТ содржани во Тризол можат да ја отворат дисулфидната врска на RNase, но сè уште има некои RNase, особено во примероците од ткиво, затоа внимавајте на ниската температура.

1.Веднаш потопете го примерокот од ткиво во течен азот откако ќе го извадите или во комерцијален раствор за зачувување на РНК.

2.По екстракцијата на РНК од клеточниот примерок, додајте ја во растворот за лиза и излијте ја на ледената кутија

3. Најдобро е да се користи течен азот за мелење кога ткивните примероци се хомогенизираат.Кога користите електричен хомогенизатор без течен азот, обрнете внимание на целосно претходно ладење на адаптерот за хомогенација.

Втората е егзогена DNase

1.Бидете целосно вооружени, носете лабораториски капут, носете маска и задолжително носете пар нови ракавици (не бидете толку штедливи!! Треба да се напомене дека Тризол е супер корозивен, а исто така е многу јак преку ракавиците, затоа не капете на вашите раце).

2.Сите употребени врвови за пипети, EP цевки, PCR цевки и друга опрема мора да бидат обработени со де-RNase.Може да се натопи во 0,1% DEPC и потоа да се под притисок под висок притисок.Обрнете внимание на работата во аспираторот.Локалните тирани можат директно да купат потрошен материјал за отстранување на ензимите.

PS: Да ви кажам еден мрзлив метод.Иако високата температура и високиот притисок не можат целосно да ја отстранат RNase, таа ќе отстрани голем дел од неа.2 пати висока температура и висок притисок има добар ефект, а екстракцијата на РНК има мал ефект.

3.Алкохолот може да ги денатурира протеините,па табелата за екстракција на РНК може да се избрише со 75% алкохол , а ракавиците може да се испрскаат и со алкохол.

4.Конечниот раствор за растворање на РНК и цевката за центрифугирање исто така треба да се третираат со де-РНаза.Водата DEPC е најчесто користен раствор за растворање на РНК.Ајде да зборуваме за правилниот начин на подготовка на DEPC вода (не заборавајте да ја препакувате комерцијалната DEPC кога ќе ја купите)

Додадете DEPC во ултрачиста вода на 1:1000, добро протресете, оставете да отстои преку ноќ на 37°C и стерилизирајте на 121°C под висока температура и висок притисок 15 минути.Водата DEPC може да се чува на -20°C во делови од 1ml.

Конечно, да сумираме: ниската температура е клучот, со потрошен материјал се ракува добро, целосно вооружени и помалку се зборува!

Па, тоа е тоа за денешната стратегија.Ти ја посакувам целата концентрација и чистота на РНК што ја спомна.Двата A260/A280 се 2.0!!!

Се разбира, ако користите аКомплет за екстракција на РНК операција за собна температура, можеби нема да наидете на горенаведените проблеми.

Операцијата на собна температура, без додавање на ДНаза, ја извлекува вкупната РНК од клетките за 11 минути, а вкупната РНК од животинските ткива или растенијата за 30 минути.

За пробни примероци, ве молиме контактирајте:overseas@foregene.com

Поврзани производи:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/