Основа за дизајн на прајмер (99% проблеми може да се решат)
1. Должина на буквар: Учебникот бара 15-30bp, обично околу 20bp.Вистинската состојба е подобро да биде 18-24bp за да се обезбеди специфичност, но колку подолго, толку подобро, предолгиот прајмер исто така ќе ја намали специфичноста и ќе го намали приносот.
2. Распон на засилување на прајмерот: 200-500bp се соодветни, а фрагментот може да се прошири до 10kb под специфични услови.
3. Основа на прајмер: Содржината на G+C треба да биде 40-60%, премалиот ефект на засилување G+C не е добар, премногу G+C лесно се појавуваат неспецифични бендови.ATGC најдобро се дистрибуира по случаен избор, избегнувајќи кластери од повеќе од 5 пурински или пиримидински нуклеотиди.Мулти-gc за 5' крај и средни секвенци за зголемување на стабилноста, избегнувајте богат GC на 3' крајот, без GC за последните 3 бази или без GC за 3 од последните 5 бази.
4. Избегнувајте секундарна структура кај прајмерите и избегнувајте комплементација помеѓу два прајмери, особено комплементација на 3-крајот, инаку ќе се формира прајмер димер и ќе се генерираат неспецифични засилени ленти.
5. Основите на 3'-крајот на прајмерите, особено последната и претпоследната основа, треба да бидат строго спарени за да се избегне дефект на PCR поради неспарени терминални бази.
6. Прајмерите имаат или можат да се додадат со соодветни места на расцепување, а засилената целна секвенца по можност треба да има соодветни места на расцепување, што е многу корисно за анализа на расцепување или молекуларно клонирање.
7. Специфичност на прајмерите: прајмерите не треба да имаат очигледна хомологија со другите секвенци во базата на податоци за секвенци на нуклеинска киселина.
8. Научете да користите софтвер: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Овој онлајн дизајн најдобро функционира).
Горенаведената содржина може да реши најмалку 99% од проблемите со дизајнот на прајмерот.
Контролирајте ги деталите за дизајнот на прајмерот
1. Должина на прајмер
Општата должина на прајмерот е 18-30 основи.Генерално, најважниот фактор што ја одредува температурата на жарење на прајмерот е должината на прајмерот.Температурата на жарење на прајмерот е генерално избрана (Tm вредност -5℃), а некои директно користат Tm вредност.Следниве формули може да се користат за грубо пресметување на температурата на жарење на прајмерите.
Кога должината на прајмерот е помала од 20bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Кога должината на прајмерот е поголема од 20bp: 62,3℃+0,41℃(%GC)-500/должина-5℃
Покрај тоа, многу софтвер, исто така, може да се користат за пресметување на температурата на жарење, принципот на пресметка ќе биде различен, па понекогаш пресметаната вредност може да има мала празнина.За да се оптимизираат PCR реакциите, се користат најкратките прајмери кои обезбедуваат температури на жарење не помали од 54℃ за најдобра ефикасност и специфичност.
Севкупно, специфичноста на прајмерот се зголемува за фактор од четири за секој дополнителен нуклеотид, така што минималната должина на прајмерот за повеќето апликации е 18 нуклеотиди.Горната граница на должината на прајмерот не е многу важна, главно поврзана со ефикасноста на реакцијата.Поради ентропијата, колку е подолг прајмерот, толку е помала брзината со која се анектира за да се врзе за целната ДНК за да формира стабилна двоверижна шаблон за врзување на ДНК полимеразата.
Кога се користи софтвер за дизајнирање на прајмери, должината на прајмерите може да се одреди според вредноста на ТМ за возврат, особено за прајмери со флуоресцентна квантитативна PCR, треба да се контролира TM=60℃ или така.
2.GC содржина
Општо земено, содржината на G+C во прајмерните секвенци е 40%~60%, а содржината на GC и вредноста на Tm на пар прајмери треба да се координираат.Ако прајмерот има сериозна тенденција за GC или AT, соодветна количина на A, T или G и C опашка може да се додаде на 5' крајот на прајмерот.
3. Температура на жарење
Температурата на жарење треба да биде 5℃ пониска од температурата на откачувањето на синџирот.Ако бројот на бази на прајмер е мал, температурата на жарење може да се зголеми соодветно, што може да ја зголеми специфичноста на PCR.Ако бројот на базите е голем, температурата на жарење може соодветно да се намали.Разликата во температурата на жарење помеѓу пар прајмери од 4℃ ~ 6℃ нема да влијае на приносот на PCR, но идеално температурата на жарење на пар прајмери е иста, што може да варира помеѓу 55℃ ~ 75℃.
4. Избегнувајте ја областа на секундарната структура на шаблонот за засилување
Најдобро е да се избегне секундарната структура на шаблонот при изборот на засилениот фрагмент.Стабилната секундарна структура на целниот фрагмент може да се предвиди и процени со релевантен компјутерски софтвер, кој е корисен за избор на шаблон.Експерименталните резултати покажуваат дека проширувањето често е неуспешно кога слободната енергија (△G) на регионот што треба да се прошири е помала од 58,6 lkJ/mol.
5. Несовпаѓање со целната ДНК
Кога засилената целна ДНК секвенца е голема, прајмер може да се врзе за повеќе делови од целната ДНК, што резултира со појава на повеќе ленти во резултатот.Овој пат е неопходно да се користи тестирањето на софтверот BLAST, веб-локација:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Изберете Порамни две секвенци (bl2seq).
Залепувањето на прајмерните секвенци во зоната 1 и целните ДНК секвенци во зоната 2 е заменливо, а BLAST пресметува комплементарни, антисенс и други можности, така што корисниците не треба да забележуваат дали и двата синџири се сетилни синџири.Можете исто така да го внесете GI бројот ако го знаете GI бројот на низата во базата на податоци, за да не морате да залепите голем дел од низата.Конечно, кликнете Align at 3 за да видите дали прајмерот има повеќе хомологни места во целната ДНК.
6. Терминал за прајмер
Крајот од 3' на прајмерот е местото каде што започнува продолжувањето, па затоа е важно да се спречат несовпаѓањата да започнат таму.3 'крајот не треба да биде повеќе од 3 последователни G или C, бидејќи тоа ќе предизвика прајмерот погрешно да се активира во регионот на секвенцата на збогатување G+C.3 'крајот не може да формира секундарна структура, освен во специјални PCR (AS-PCR) реакции, 3' крајот на прајмерот не може да се совпаѓа.На пример, ако областа за кодирање е засилена, 3' крајот на прајмерот не треба да се завршува на третата позиција на кодонот, бидејќи третата позиција на кодон е склона кон дегенерација, што ќе влијае на специфичноста и ефикасноста на засилувањето.Кога користите анексациони прајмери, погледнете ја табелата за употреба на кодон, обрнете внимание на биолошката предност, не користете анексирачки прајмери на крајот од 3′ и користете поголема концентрација на прајмери (1uM-3uM).
7. Секундарна структура на прајмери
Самите прајмери не треба да имаат комплементарни секвенци, инаку самите прајмери ќе се преклопат во структури за фиба, а оваа секундарна структура ќе влијае на врзувањето на прајмерите и шаблоните поради стеричната пречка.Ако се користи вештачко расудување, континуираните комплементарни основи на самите прајмери не треба да бидат поголеми од 3 bp.Не треба да има комплементарност помеѓу двата прајмери, особено треба да се избегнува комплементарното преклопување на 3' крајот за да се спречи формирање на димери на прајмер.Општо земено, не треба да има повеќе од 4 последователни хомологија на бази или комплементарност помеѓу пар прајмери.
8. Додадете маркери или локуси
5' крајот има мало влијание врз специфичноста на засилувањето и затоа може да се модифицира без да влијае на специфичноста на засилувањето.Модификацијата на крајот на прајмерот 5 вклучуваше: додавање место за ограничување на ензимот;Обележан биотин, флуоресценција, дигоксин, Eu3+, итн. Воведување на секвенци на ДНК врзувачки за протеините;Воведување места на мутација, вметнување и недостиг на секвенци на мутации и воведување на промоторни секвенци, итн. Дополнителните бази повеќе или помалку ќе влијаат на ефикасноста на засилување и ќе ја зголемат шансата за формирање на димери на прајмер, но мора да се направат некои отстапки за следниот чекор.Дополнителни секвенци кои не постојат на целната секвенца, како што се рестриктивни места и промоторни секвенци, може да се додадат на 5' крајот на прајмерот без да се влијае на специфичноста.Овие секвенци не се вклучени во пресметката на вредностите на прајмерот Tm, но треба да се тестираат за комплементарност и внатрешна секундарна структура.
9. Субклони
Најчесто, PCR е само прелиминарно клонирање, а потоа треба да го субклонираме целниот фрагмент во различни вектори, така што треба да дизајнираме дополнителни бази за следната операција во чекорот на PCR.
Некои секвенци дизајнирани за субклонирање се сумирани подолу.
Беше додадено место за ограничување на рестриктивната ендонуклеаза
Додавањето места за ензимска рестрикција е најчесто користениот метод за субклонирање на PCR производи.Општо земено, местото на расцепување е шест бази, во прилог на 5 'крајот на местото на расцепување треба да додадете 2 ~ 3 заштитни основи.Сепак, бројот на заштитни бази што ги бараат различни ензими е различен.На пример, SalⅠ не бара заштитна основа, EcoRⅤ бара 1 заштитна основа, NotⅠ бара 2 заштитни основи и Hind Ⅲ бара 3 заштитни основи.
LIC ја додава опашката
Целосното име на LIC е клонирање независно од лигатура, метод на клонирање измислен од Навоген специјално за неговиот дел од векторот pET.Носачот на pET подготвен со LIC методот има некомплементарни лепливи краеви од 12-15 бази, кои ги надополнуваат соодветните лепливи краеви на целниот фрагмент за вметнување.За цели на засилување, прајмерската 5' секвенца на вметнатиот фрагмент треба да го надополни LIC векторот.Екстранектната активност 3'→5' на Т4 ДНК полимеразата може да формира леплив крај со една жичка на вметнатиот фрагмент по кратко време.Бидејќи производот може да се формира само од взаемно жарење на подготвениот фрагмент од влошката и векторот, овој метод е многу брз и ефикасен и е насочено клонирање.
Режија TA клон додадете опашка
Клонирањето на ТА не беше во можност да го насочи фрагментот во вектор, па подоцна Invitrogen воведе вектор кој може да го таргетира клонирањето, кој содржеше четири истакнати бази GTGGS на едниот крај.Затоа, при дизајнирањето на PCR прајмери, треба соодветно да се додадат комплементарни секвенци, за да може фрагментите да се „ориентираат“.
Ако немате време, можете да пробате директна синтеза, комбинирајќи го генот со векторот, што е она што го нарекуваме синтеза на ЕТ ген кај мусекуларистите.
D. Метод на клонирање во фузија
Не е потребна лигаза, не е потребна долга реакција.Сè додека се воведува низа на двата краја на линеаризираниот вектор Во дизајнот на прајмери, тогаш производот PCR и линеаризираниот вектор се додаваат во растворот за ензим за фузија што содржи BSA и се ставаат на собна температура половина час, трансформацијата може да се изврши.Овој метод е особено погоден за конверзија со голем волумен.
10. Спојување на прајмер
Понекогаш, само ограничени информации за низата се познати за дизајнот на прајмерот.На пример, ако е позната само амино киселинската секвенца, може да се дизајнира спојувачкиот прајмер.Прајмерот за спојување е мешавина од различни секвенци што ги претставуваат сите различни базни можности што кодираат една амино киселина.За да ја зголемите специфичноста, можете да се повикате на табелата за употреба на кодон за да ја намалите анексијата според преференциите за основна употреба на различни организми.Хипоксантинот може да се спои со сите основи за да се намали температурата на жарење на прајмерот.Не користете ги приложените основи на 3' крајот на прајмерот бидејќи жарењето на последните 3 бази на 3' крајот е доволно за да се иницира PCR на погрешно место.Се користат повисоки концентрации на прајмер (1μM до 3μM) бидејќи прајмерите во многу мешавини за приклучување не се специфични за целниот шаблон.
PCR суровиниконтрола
1. Количина на прајмер
Концентрацијата на секој прајмер е 0,1 ~ 1umol или 10 ~ 100pmol.Подобро е да се произведе потребниот резултат со најмала количина прајмер.Високата концентрација на прајмер ќе предизвика несовпаѓање и неспецифично засилување и ќе ја зголеми шансата за формирање димери помеѓу прајмерите.
2. Концентрација на прајмер
Концентрацијата на прајмери влијае на специфичноста.Оптималната концентрација на прајмер е генерално помеѓу 0,1 и 0,5 μM.Повисоките концентрации на прајмер доведуваат до засилување на неспецифични производи.
3. Температура на жарење на прајмерот
Друг важен параметар за прајмерите е температурата на топење (Tm).Ова е температурата кога 50% од прајмерите и комплементарните секвенци се претставени како двоверижна ДНК молекули.Tm е потребен за да се постави температурата на жарење со PCR.Идеално, температурата на жарење е доволно ниска за да обезбеди ефективно жарење на прајмерите со целната низа, но доволно висока за да се намали неспецифичното врзување.Разумна температура на жарење од 55℃ до 70℃.Температурата на жарење обично е поставена 5℃ пониска од Tm на прајмерот.
Постојат неколку формули за поставување на Tm, кои многу варираат во зависност од употребената формула и редоследот на прајмерите.Бидејќи повеќето формули обезбедуваат проценета вредност на Tm, сите температури на жарење се само почетна точка.Специфичноста може да се подобри со анализа на неколку реакции кои прогресивно ја зголемуваат температурата на жарење.Започнете под проценетиот Tm-5℃ и постепено зголемувајте ја температурата на жарење со зголемување од 2℃.Повисоката температура на жарење ќе го намали формирањето на димери на прајмер и неспецифични производи.За најдобри резултати, двата прајмери треба да имаат приближни вредности на Tm.Ако Tm разликата на паровите на прајмери е повеќе од 5℃, прајмерите ќе покажат значителен погрешен почеток со користење на пониска температура на жарење во циклусот.Ако двата прајмери Tm се различни, поставете ја температурата на жарење на 5℃ пониска од најниската Tm.Алтернативно, за да се зголеми специфичноста, пет циклуси може да се изведат прво на температури на жарење дизајнирани за повисоки Tm, проследени со преостанатите циклуси на температури на жарење дизајнирани за пониски Tm.Ова овозможува да се добие делумна копија од дестинацијата шаблон под тесни услови.
4. Чистота и стабилност на прајмерот
Стандардната чистота на сопствените прајмери е соодветна за повеќето PCR апликации.Отстранувањето на бензоил и изобутилилните групи со десолење е минимално и затоа не се меша со PCR.Некои апликации бараат прочистување за да се отстранат сите секвенци со целосна должина во процесот на синтеза.Овие скратени секвенци настануваат затоа што ефикасноста на хемијата за синтеза на ДНК не е 100%.Ова е кружен процес кој користи повторени хемиски реакции додека секоја база се додава за да се направи ДНК од 3' до 5'.Може да не успеете во секој циклус.Подолгите прајмери, особено оние поголеми од 50 бази, имаат голем дел од скратени секвенци и може да бараат прочистување.
Приносот на прајмери е под влијание на ефикасноста на синтетичката хемија и методот на прочистување.Биофармацевтските компании, како што се Цитологија и Шенгонг, сите користат минимална единица за ОД за да го обезбедат вкупниот излез на олигонуклеозид.Прилагодените прајмери се испорачуваат во форма на сув прашок.Најдобро е повторно да се растворат прајмерите во ТЕ така што крајната концентрација е 100μM.ТЕ е подобра од дејонизираната вода бидејќи pH вредноста на водата е често кисела и предизвикува хидролиза на олигонуклеозидите.
Стабилноста на прајмерите зависи од условите за складирање.Сувиот прав и растворените прајмери треба да се чуваат на -20℃.Прајмерите растворени во ТЕ во концентрации поголеми од 10μM можат стабилно да се чуваат на -20℃ 6 месеци, но може да се чуваат само на собна температура (15℃ до 30℃) помалку од 1 недела.Прајмерите за сув прашок може да се чуваат на -20 C најмалку 1 година и на собна температура (15 C до 30 C) до 2 месеци.
5. Ензими и нивните концентрации
Во моментов, употребената Taq ДНК полимераза е во основа ензим за инженерство на гени синтетизиран од колиформни бактерии.Количината на ензимот потребна за катализирање на типична PCR реакција е околу 2,5 U (се однесува на вкупниот волумен на реакција од 100 ul).Ако концентрацијата е превисока, тоа може да доведе до неспецифично засилување;ако концентрацијата е премногу ниска, количината на синтетички производ ќе се намали.
6. Квалитет и концентрација на dNTP
Квалитетот на dNTP е тесно поврзан со концентрацијата и ефикасноста на PCR засилувањето.Прашокот dNTP е грануларен, а неговата варијабилност ја губи биолошката активност ако е неправилно складиран.dNTP растворот е кисел и треба да се користи во висока концентрација, со 1M NaOH или 1M Tris.HCL пуферски раствор за прилагодување на неговата PH на 7,0 ~ 7,5, мала количина на под-пакување, замрзнато складирање на -20℃.Повеќекратното замрзнување-одмрзнување ќе го деградира dNTP.При PCR реакција, dNTP треба да биде 50 ~ 200 umol/L.Особено, треба да се обрне внимание на концентрацијата на четирите DNTPS треба да биде еднаква (еднаква подготовка на молови).Ако концентрацијата на која било од нив е различна од другите (повисока или помала), ќе се предизвика несовпаѓање.Премногу ниска концентрација ќе го намали приносот на PCR производи.dNTP може да се комбинира со Mg2+ и да ја намали концентрацијата на слободниот Mg2+.
7. Шаблон (целен ген) нуклеинска киселина
Количината и степенот на прочистување на шаблонската нуклеинска киселина е една од клучните врски за успехот или неуспехот на PCR.Традиционалните методи за прочистување на ДНК обично користат SDS и протеаза К за варење и отстранување на примероците.Главните функции на СДС се: растворање на липиди и протеини на клеточната мембрана, со што се уништува клеточната мембрана со растворање на мембранските протеини и дисоцирање на нуклеарните протеини во клетката, СДС исто така може да се комбинира со протеините и да таложи;Протеазата К може да ги хидролизира и вари протеините, особено хистоните врзани со ДНК, а потоа да користи органски растворувач фенол и хлороформ за екстракција на протеини и други клеточни компоненти и да користи етанол или изопропил алкохол за таложење на нуклеинска киселина.Извлечената нуклеинска киселина може да се користи како шаблон за PCR реакции.За општа клиничка детекција примероци, брз и едноставен метод може да се користи за растворање на клетки, лизирање на патогени, варење и отстранување на протеините од хромозомите до слободни целни гени и директно се користи за PCR засилување.Екстракцијата на шаблонот на РНК обично користи метод на гванидин изотиоцијанат или протеаза К за да се спречи RNase да ја разградува РНК.
8.Mg2+ концентрација
Mg2+ има значаен ефект врз специфичноста и приносот на PCR засилување.Во општа PCR реакција, кога концентрацијата на различни dNTP е 200umol/L, соодветната концентрација на Mg2+ е 1,5 ~ 2,0mmol/L.Концентрацијата на Mg2+ е премногу висока, специфичноста на реакцијата се намалува, се јавува неспецифично засилување, премногу ниската концентрација ќе ја намали активноста на Taq ДНК полимеразата, што резултира со намалување на производите на реакцијата.
Магнезиумовите јони влијаат на неколку аспекти на PCR, како што е активноста на ДНК полимеразата, која влијае на приносот;Друг пример е жарењето со прајмер, што влијае на специфичноста.dNTP и шаблонот се врзуваат за јон на магнезиум, намалувајќи го количеството на слободен јон на магнезиум потребен за ензимската активност.Оптималната концентрација на јони на магнезиум варира за различни парови на прајмери и шаблони, но типична почетна концентрација на PCR со 200μM dNTP е 1,5 mM (забелешка: за квантитативна PCR во реално време, користете 3 до 5 mM раствор на магнезиум јонски со флуоресцентна сонда).Повисоките концентрации на слободни јони на магнезиум го зголемуваат приносот, но исто така го зголемуваат неспецифичното засилување и ја намалуваат верноста.За да се одреди оптималната концентрација, титрациите на јоните на магнезиум беа извршени во чекори од 0,5 mM од 1 mM до 3 mM.За да се намали зависноста од оптимизација на магнезиум јони, може да се користи Platinum Taq DNA полимераза.Platinum Taq DNA полимеразата е во состојба да одржува функција во поширок опсег на концентрации на магнезиум јони од Taq DNA полимеразата и затоа бара помала оптимизација.
9. Адитиви кои промовираат Pcr
Оптимизацијата на температурата на жарење, дизајнот на прајмерот и концентрацијата на јони на магнезиум е доволна за високо специфично засилување на повеќето шаблони;сепак, некои шаблони, вклучително и оние со висока содржина на GC, бараат дополнителни мерки.Адитивите кои влијаат на температурата на топење на ДНК обезбедуваат уште еден начин за подобрување на специфичноста и приносот на производот.Потребна е целосна денатурација на шаблонот за најдобри резултати.
Покрај тоа, секундарната структура го спречува врзувањето на прајмерот и проширувањето на ензимите.
PCR адитиви, вклучувајќи формамид, DMSO, глицерин, бетаин и PCRx Enhancer Solution, го подобруваат засилувањето.Нивниот можен механизам е да ја намалат температурата на топење, со што ќе го помогнат жарењето на прајмерите и помагајќи да се прошири ДНК полимеразата низ регионот на секундарната структура.PCRx решението има и други предности.Потребна е минимална оптимизација на магнезиум јони кога се користи со Platinum Taq DNA полимераза и Platinum Pfx DNA полимераза.Така, техниката Платинум е комбинирана со адитивот за да се зголеми специфичноста додека се намалува зависноста од третиот пристап, оптимизација на јони на магнезиум.За најдобри резултати, концентрацијата на адитиви треба да се оптимизира, особено DMSO, формамид и глицерол, кои ја инхибираат Taq DNA полимеразата.
10. Топол почеток
Hot start PCR е еден од најважните методи за подобрување на специфичноста на PCR, покрај добриот дизајн на прајмерот.Иако оптималната температура на издолжување на Taq DNA полимеразата е 72℃, полимеразата останува активна на собна температура.Така, неспецифични производи се произведуваат кога температурата на задржување е пониска од температурата на жарење за време на подготовката на PCR реакцијата и на почетокот на термичкиот циклус.Откако ќе се формираат, овие неспецифични производи ефективно се засилуваат.ПЦР со топол почеток е особено ефективен кога местата што се користат за дизајнирање на прајмери се ограничени од локацијата на генетските елементи, како што се мутации насочени кон локацијата, клонирање на експресијата или изградба и манипулација со генетски елементи што се користат за инженерство на ДНК.
Вообичаен метод за ограничување на активноста на Taq DNA полимеразата е да се подготви раствор за реакција на PCR на мраз и да се стави во претходно загреан PCR апарат.Овој метод е едноставен и ефтин, но не ја комплетира активноста на ензимот и затоа не го елиминира целосно засилувањето на неспецифични производи.
Термичкото прајминг ја одложува синтезата на ДНК со инхибиција на суштинска компонента додека PCR апаратот не достигне температура на денатурација.Повеќето методи за рачно термичко иницирање, вклучително и одложено додавање на Taq DNA полимераза, се незгодни, особено за апликации со висока пропусност.Други методи на термичко грундирање користат восочен штит за да се загради суштинска компонента, вклучувајќи јони или ензими на магнезиум, или за физички изолирање на реактивни компоненти, како што се шаблони и пуфери.За време на термичкиот циклус, различните компоненти се ослободуваат и се мешаат додека восокот се топи.Како и методот на рачно жешко стартување, методот на восочен штит е тежок и склон кон контаминација и не е погоден за апликации со висока пропусност.
Платинската ДНК полимераза е удобна и ефикасна за автоматско жешко стартување на PCR.Platinum Taq DNA полимеразата се состои од рекомбинантна Taq DNA полимераза комбинирана со моноклонално антитело против Taq DNA полимеразата.Антителата се формулираат со PCR за да ја инхибираат ензимската активност при продолжено задржување на температурата.Taq ДНК полимеразата беше ослободена во реакцијата за време на изолацијата од 94℃ на чекорот на денатурација, враќајќи ја целосната активност на полимеразата.За разлика од хемиски модифицираната Taq DNA полимераза за термичка иницијација, ензимот платина не бара продолжена изолација на 94℃ (10 до 15 минути) за да ја активира полимеразата.Со PlatinumTaq DNA полимеразата, 90% од активноста на Taq DNA полимеразата беше обновена по 2 минути на 94℃.
11. Nest-PCR
Последователните кругови на засилување со користење на вгнездени прајмери може да ја подобрат специфичноста и чувствителноста.Првиот круг е стандардно засилување од 15 до 20 циклуси.Мал дел од почетниот производ за засилување беше разреден 100 до 1000 пати и додаден во вториот круг на засилување за 15 до 20 циклуси.Алтернативно, почетниот засилен производ може да се мери со гел прочистување.Во вториот круг на засилување се користи вгнезден прајмер, кој може да се поврзе со целната секвенца во првиот прајмер.Употребата на вгнездена PCR ја намалува можноста за засилување на повеќе целни места бидејќи има неколку целни секвенци комплементарни за двете групи на прајмери.Истиот вкупен број на циклуси (30 до 40) со исти прајмери ги засили неспецифичните места.Вгнездениот PCR ја зголемува чувствителноста на ограничените целни секвенци (на пр., ретки мрни) и ја подобрува специфичноста на тешкиот ПЦРС (на пр. 5' RACE).
12. Опаѓачки PCR
Намалувањето на PCR ја подобрува специфичноста со користење на тесни услови за жарење за првите неколку циклуси на PCR.Циклусот започнува на температура на жарење приближно 5℃ повисока од проценетата Tm, а потоа секој циклус се намалува за 1℃ до 2℃ додека температурата на жарење не биде под Tm 5℃.Ќе се засили само дестинацијата со највисока хомологија.Овие производи продолжуваат да се прошируваат во следните циклуси, истиснувајќи ги засилените неспецифични производи.Опаѓачката PCR е корисна за методи каде што не е познат степенот на хомологија помеѓу прајмерот и целниот шаблон, како што е отпечатокот на ДНК на AFLP.
Поврзани комплети за PCR
Херојот 2× PCRTMМикс системот има поголема толеранција на PCR инхибитори од обичниот PCR Mix систем и лесно може да се справи со PCR засилување на различни сложени шаблони.Уникатниот систем за реакција и високата ефикасност Taq Hero прават реакцијата на PCR да има поголема ефикасност на засилување, специфичност и чувствителност.
Поголема ефикасност на засилување
Има 5'→3' ДНК полимеразна активност и 5'→3' егзонуклеазна активност, без 3'→5' егзонуклеазна активност.
Комплет Easyᵀᴹ-SYBR Green I PCR во реално време
Специфичен - оптимизиран пуфер и ензим Taq со топла стартување може да спречи неспецифично засилување и формирање на димер на прајмер
Висока чувствителност - може да открие ниски копии на шаблон
Комплетот користи уникатен Foregene реагенс за обратна транскрипција и Foregene HotStar Taq DNA полимераза во комбинација со уникатен систем за реакција за ефикасно подобрување на ефикасноста на засилување и специфичноста на реакцијата.
Време на објавување: мај-09-2023 година
