Традиционалните реверзни транскриптази не можат да толерираат високи температури (оптималната температура за MMLV активност е 37-50°C, а AMV е 42-60°C).Покомплексната вирусна РНК не може ефективно да се транскрибира во cDNA на ниски температури, што резултира со ефикасност на откривање Намалување.Традиционалниот RT-qPCR генерално бара учество на два клучни ензими (реверзна транскриптаза и ДНК полимераза), што го оневозможува поедноставувањето на работата на системот за реакција и намалувањето на трошоците.Овде ќе воведеме две реверзни транскриптази отпорни на високи температури, TtH и RevTaq.Овие два ензима имаат и функција на ДНК полимераза, па затоа се нарекуваат бифункционални ензими.

TtH ДНК полимераза

Сигурно сте слушнале за TtH, кој потекнува од термофилната бактерија Thermus thermophilus HB8.Во присуство на двовалентни катјони како што е Mg2+, има активност на ДНК полимераза.Широко се користи во PCR реакции како Taq ензимот, но има поголема отпорност на топлина од Taq ензимот, така што исто така има подобар ефект врз PCR со шаблони со висока содржина на GC.

· Овој ензим во основа нема 3'→5' егзонуклеазна активност и 5'→3' егзонуклеазна активност, така што може да се користи и за дидеокси секвенционирање.

· Овој ензим има RTase активност.Во присуство на Mn2+, активноста на RTase ќе биде засилена.Користејќи ја оваа функција, може да се користи за да се изврши реакција на обратна транскрипција и реакција на PCR во истата цевка, односно RT-PCR во еден чекор.Меѓутоа, во присуство на Mn2+, точноста на RT-PCR не е висока.Активноста на RT нема никаква врска со активноста на рнаазата H.

· Зголемената активност на Tth-DNA полимеразата (pH9, оптимален +55℃~70℃, максимум +95℃) ги надминува проблемите предизвикани од секундарната структура на РНК.Добиената cDNA може да се засили со PCR со истиот ензим во присуство на Mg2+ јони.

· Способноста на Tth-DNA полимеразата да врши обратна транскрипција и засилување на ДНК на високи температури го прави овој ензим корисен за квантитативна RT-PCR, клонирање и анализа на генска експресија на клеточна и вирусна РНК.
· Tth-DNA полимеразата се користи за RT-PCR за засилување на РНК до 1 kb.

Карактеристики и предности

Tth ДНК полимераза:

• Обезбедете ја големината на производот со оптимизирана полимеразна верижна реакција (PCR), најмалку 1000 bp во реакцијата RT-PCR

• Прифатете го модифицираниот деоксирибонуклеозид трифосфат како супстрат

• Не е поврзано со активноста на RNase H

• Има висока термичка стабилност за надминување на проблемите, обично поврзани со високата секундарна структура присутна во РНК

RevTaq RT-PCR ДНК полимераза

ДНК полимераза отпорна на топлина со активност на обратна транскриптаза

RevTaq-RT-PCR-DNA полимеразата е инженерски, високо отпорен на топлина, двофункционален ензим со активности на реверзна транскриптаза и ДНК полимераза добиени преку насочена и вештачка еволуција.

· Полуживотот на RevTaq RT-PCR ДНК полимеразата на 95°C е поголем од 40 минути.

· RevTaq RT-PCR ДНК полимеразата овозможува реверзна транскрипција на висока температура директно од шаблонот на РНК, а чекорот на обратна транскрипција може да се повтори повеќе пати за да се генерираат повеќе шаблони на cDNA.

· RevTaq RT-PCR ДНК полимеразата дозволува RT-PCR во „нулта чекор“ (без изотермичен чекор на обратна транскрипција), бидејќи во чекорот на циклично продолжување на PCR, обратна транскрипција и засилување на ДНК се случуваат истовремено.Ова, исто така, ја промовира реакцијата на обратна транскрипција на високи температури, со што се минимизираат проблемите што се среќаваат при топењето на силната секундарна структура во РНК при високи температури.

· Поради формулата за топол старт базиран на аптамер, RevTaq RT-PCR ДНК полимеразата ќе даде подобри резултати кога температурата на жарење и продолжување е повисока од 57°C.

· Бидејќи ензимот е отпорен на топлина, се препорачува да се дизајнираат прајмери ​​и сонди со многу високи точки на топење (>60°C).

· Се препорачува да се оптимизира температурата на чекорот на жарење/продолжување преку температурен градиент за време на процесот на поставување на реакцијата.

· Колку е повисока температурата, толку е поголема специфичноста на PCR.Циклусот на обратна транскрипција обично се изведува на повисока температура од циклусот на PCR, бидејќи хибридизацијата на шаблонот на DNA Primer:RNA обично има повисока точка на топење од дуплексот на DNA Primer:cDNA Шаблон.

· RevTaq RT-PCR ДНК полимеразата е генетски конструирана и оптимизирана, а големината на ампликонот е помеѓу 60-300 bp.

Границата за откривање на ДНК полимераза на RevTaq RT-PCR достигнува 4 копии/

Оптимизираниот систем за реакција (воспоставување прајмери ​​со висока точка на топење) е прикажан на сликата.RevTaq RT-PCR ДНК полимераза управуван RT-PCR покажува подобра чувствителност од TaqPath 1-чекор RT-qPCR мастер микс и помал градиент на разредување на примерокот за откривање.

Повеќе предности:

Функција за брз почеток → Почетниот чекор на термичка денатурација може да се прескокне.

Формула за аптамер со топол старт → Обезбедете 100% ензимска активност веднаш и спречете неспецифично засилување при ниски температури (<57°C).

Функција на расцепување → Чекорот за екстракција на РНК е испуштен, бидејќи RevTaq RT-PCR ДНК полимеразата може да обработува и сурови реакциони примероци.Може веднаш да ги уништи клеточните мембрани на еукариотите, бактериите и вирусите во врел RT-PCR циклус.

IVD ниво на суровина → високи стандарди за квалитет и исклучително конкурентни цени