Ⅰ. Зголемете ја чувствителноста на системот за реакција:

1. Одделна висококвалитетна РНК:

Успешната синтеза на cDNA доаѓа од висококвалитетна РНК.Висококвалитетната РНК треба да обезбеди барем вкупно подолго време и да не содржи инхибитори кои не содржат ензими за снимање, како што се EDTA или SDS.Квалитетот на РНК ја одредува максималната вредност на информациите за низата што можете да ги препишете на cDNA.Општиот метод за прочистување на РНК е чекор метод на користење изоцијанат/ацидофенол.Со цел да се спречи загадувањето на RNase, РНК одвоена од примерок богат со RNase (како што е панкреасот) бара складирање на формалдехид за да се спаси висококвалитетната РНК, што е уште повеќе за долгорочно складирање.РНК извлечена од црниот дроб на стаорец во основа беше деградирана по една недела складирање во вода, додека РНК извлечена од слезината на стаорец остана стабилна по три години складирање во вода.Дополнително, транскриптите поголеми од 4 kb се почувствителни на деградација на RNase во трага отколку малите транскрипти.Со цел да се зголеми стабилноста на примерокот за складирање на РНК, РНК може да се раствори во јонски металмамин и да се складира -70 °C.Тилидот што се користи за зачувување на РНК не смее да содржи различен предмет што ја разградува РНК.РНК, која потекнува од панкреасот, може да се чува во металмамин најмалку една година.Кога сте подготвени да користите РНК, можете да ги користите следниве методи за таложење на РНК: додадете NaCl до 0,2 m и 4 пати поголем од волуменот на етанолот, ставете на собна температура 3-5 минути и 10.000 × g центрифугално 5 минути.

2. Користете реверзна транскриптаза без активност на RNaseH (RNaseH-):

Инхибиторите на RNase често се додаваат во реакциите на обратна транскрипција за да се зголеми должината и приносот на синтезата на cDNA.Инхибиторот на RNase се додава во првата синтеза на синтеза во присуство на пуфери и редуцирачки агенси како што е DTT бидејќи процесот на синтеза пред cDNA го денатурира инхибиторот, со што се ослободува врзаните RNase кои ја разградуваат РНК.Инхибиторот на протеинската RNase само го спречува разградувањето на РНК од страна на RNase A, B, C и не ги спречува RNases на кожата, затоа треба да се внимава да не се внесуваат RNase од прстите и покрај употребата на овие инхибитори.

Обратна транскриптаза ја катализира конверзијата на РНК во cDNA.И M-MLV и AMV имаат ендогена активност на RNaseH како додаток на нивната сопствена полимеразна активност.Активноста на RNaseH се натпреварува со активноста на полимеразата за хетерозиготни нишки формирани помеѓу шаблони на РНК и ДНК прајмери ​​или нишки за продолжување на cDNA, и ги разградува нишките на РНК: РНК во ДНК комплексите.Шаблони на РНК деградирани со активност на RNaseH повеќе не можат да се користат како ефективни супстрати за синтеза на cDNA, намалувајќи го приносот и должината на синтезата на cDNA.Така, елиминирањето или значително намалувањето на активноста на RNaseH на реверзната транскриптаза би било од голема корист.

SuperScriptⅡ реверзна транскриптаза, MMLV обратна транскриптаза на RNaseH- и thermoScript реверзна транскриптаза, AMV на RNaseH- дадоа повеќе cDNA со целосна должина од MMLV и AMV.Чувствителноста на RT-PCR е под влијание на количината на синтетизирана cDNA.ThermoScript е многу почувствителен од AMV.Големината на RT-PCR производите е ограничена од способноста на реверзната транскриптаза да синтетизира cDNA, особено кога се клонираат поголеми Cdnas.Во споредба со MMLV, SuperScripⅡ значително го зголеми приносот на долгите RT-PCR производи.Реверзната транскриптаза на RNaseH-, исто така, ја зголемува термичката стабилност, така што реакцијата може да се изврши на температури повисоки од нормалните од 37-42℃.Под предложените услови за синтеза, користени се oligo(dT) прајмери ​​и 10μCi [alpha-p]dCTP.Вкупното производство на првиот синџир беше пресметано со користење на методот на врнежи TCA.Целосната cDNA беше анализирана со отстранување на ленти подредени по големина и броење во алкален агарозен гел.

3. Зголемете ја температурата на зачувување на топлина на обратна транскрипција:

Повисоката температура на задржување помага да се отвори секундарната структура на РНК и да се зголеми приносот на реакцијата.За повеќето шаблони на РНК, држењето на РНК и прајмерот на 65°C без пуфер или сол и потоа брзото ладење на мраз ги елиминира повеќето секундарни структури и им овозможува на прајмерите да се врзат.Сепак, некои шаблони сè уште имаат секундарна структура, дури и по термичка денатурација.Засилувањето на овие тешки шаблони може да се изврши со помош на реверзна транскриптаза ThermoScript и со поставување на реакцијата на обратна транскриптаза на повисоки температури за да се подобри засилувањето.Повисоките температури на задржување исто така може да ја зголемат специфичноста, особено кога синтезата на cDNA се изведува со користење на ген-специфични прајмери ​​(GSPS) (види Поглавје 3).Ако користите GSP, проверете дали вредноста на Tm на прајмерот е иста со очекуваната температура на задржување.Не користете олиго(dT) и случајни прајмери ​​над 60℃.Случајните прајмери ​​треба да се држат на 25℃ 10 минути пред да се зголемат на 60℃.Покрај користењето на повисоки температури на обратна транскрипција, специфичноста може да се подобри со директно пренесување на мешавината на РНК/прајмер од 65℃ температура на денатурирање до температурата на задржување на обратна транскрипција и додавање на претходно загреана 2× реакциона смеса (синтеза за термичка иницијација на cDNA).Овој пристап помага да се спречи меѓумолекуларното спарување на базите што се случува на пониски температури.Користењето на PCR инструмент ги поедноставува многуте температурни прекинувачи потребни за RT-PCR.

Tth топлински стабилизирана полимераза делува како ДНК полимераза во присуство на Mg2+ и RNA полимераза во присуство на Mn2+.Може да држи топлина до 65℃.Сепак, присуството на Mn2+ за време на PCR ја намалува верноста, што ја прави Tth полимеразата помалку погодна за амплификација со висока прецизност, како што е клонирање на cDNA.Покрај тоа, Tth е помалку ефикасен при обратна транскрипција, што ја намалува чувствителноста, и бидејќи еден ензим може да изврши обратна транскрипција и PCR, контролните реакции без обратна транскрипција не може да се користат за да се разликуваат засилените производи на cDNA од оние на контаминирана геномска ДНК.

4. Адитив кој промовира обратна транскрипција:

Додавањето адитиви, вклучително и глицерин и DMSO, во првата синтеза на синтеза може да ја намали стабилноста на двојната нишка на нуклеинската киселина и да ја одвитка секундарната структура на РНК.Може да се додаде до 20% глицерин или 10% DMSO без да влијае на активноста на SuperScriptⅡ или MMLV.АМВ исто така може да толерира до 20% глицерол без да ја намалува активноста.За да се зголеми чувствителноста на RT-PCR во реакцијата на обратна транскрипција SuperScriptⅡ, може да се додаде 10% глицерол и да се изолира на 45℃.Ако 1/10 од производот за ретротранскрипција-реакција се додаде на PCR, концентрацијата на глицерол во реакцијата на засилување е 0,4%, што не е доволно за да се инхибира PCR.

5. Обработка на RNaseH:

Чувствителноста може да се подобри со третирање на реакции на синтеза на cDNA со RNaseH пред PCR.За некои шаблони, се смета дека РНК во реакцијата на синтеза на cDNA го спречува врзувањето на засилените производи, во кој случај третманот со RNaseH може да ја зголеми чувствителноста.Општо земено, третманот со RNaseH е потребен за засилување на релативно долга целна шема на cDNA со целосна должина, како што е туберозна шерозаⅡ со мала копија.За овој тежок шаблон, RNaseH го подобри сигналот генериран од cDNA синтетизирана од SuperScriptⅡ или AMV.За повеќето RT-PCR реакции, третманот со RNaseH е изборен бидејќи чекорот на денатурација на PCR изолиран од 95℃ обично ја хидролизира РНК од комплексот РНК: ДНК.

6. Подобрени методи за откривање на мали количини на РНК:

RT-PCR е особено предизвикувачки кога се достапни само мали количини на РНК.Додавањето на гликоген како носител за време на сепарацијата на РНК помага да се зголеми приносот на мали примероци.Во исто време со Trizol може да се додаде гликоген без RNase.Гликогенот е растворлив во вода и може да остане во водната фаза со РНК за да помогне во последователните врнежи.Препорачаната концентрација на гликоген без RNase е 250 μg/ml за примероци помали од 50 mg ткиво или 106 култивирани клетки.

Додавањето на ацетилирана BSA за реакции на обратна транскрипција со помош на SuperScriptⅡ може да ја зголеми чувствителноста, а за мали количини на РНК, намалувањето на количината на SuperScriptⅡ и додавањето 40 единици RnaseOut инхибитор на нуклеаза може да го подобри нивото на детекција.Доколку се користи гликоген при сепарација на РНК, се препорачува додавање на инхибитори на BSA или RNase за да се вратат реакциите на транскрипција со помош на SuperScriptⅡ.

Ⅱ. Зголемете ја специфичноста на RT-PCR

1. CNDA синтеза:

Може да се користат три различни методи за да се иницира синтеза на cDNA на првата нишка, а релативната специфичност на секој метод влијае на количината и видот на синтетизираната cDNA.

Методот на случаен прајмер е најмалку специфичен од трите методи.Прајмерите се варат на повеќе места низ транскриптот за да се произведе кратка, делумна должина на cDNA.Овој метод често се користи за да се добијат 5' терминални секвенци и cDNA од шаблони на РНК со секундарни структурни региони или со завршни места кои реверзната транскриптаза не може да се реплицира.За да се добие најдолгата cDNA, односот на прајмери ​​со РНК во секој примерок од РНК треба да се определи емпириски.Почетната концентрација на случајните прајмери ​​се движи од 50 до 250 ng на 20 μl систем за реакција.Бидејќи cDNA синтетизирана од вкупната РНК со користење на случајни прајмери ​​е главно рибозомална РНК, поли(А)+РНК генерално се избира како шаблон.

Иницијацијата на олиго(dT) е поспецифична од случајните прајмери.Се хибридизира со поли(А) опашката која се наоѓа на 3' крајот на mRNA во повеќето еукариотски клетки.Бидејќи поли(А)+РНК е приближно 1% до 2% од вкупната РНК, количината и сложеноста на cDNA е многу помала отколку кога би се користеле случајни прајмери.Поради неговата висока специфичност, олиго(dT) генерално не бара оптимизација за односот на РНК со прајмер и селекција на поли(А)+.Се препорачува да се користат 0,5μg олиго(dT) на 20μl систем за реакција.oligo(dT)12-18 е погоден за повеќето RT-PCR.Системот ThermoScript RT-PCR обезбедува oligo(dT)20 поради неговата добра термичка стабилност и е погоден за повисоки температури на задржување.

Ген-специфични прајмери ​​(GSP) се најдобрите специфични прајмери ​​за чекорот на обратна транскрипција.GSP е антисенс олигонуклеозид кој може специфично да се хибридизира со одредишните секвенци на РНК, наместо да ги анелира сите Rnas како случајни прајмери ​​или олиго(dT).Правилата што се користат за дизајнирање на PCR прајмери ​​важат и за дизајнот на реакцијата на обратна транскрипција GSP.GSP може да биде иста низа како и амплифицирачкиот прајмер кој е аниран на крајот од mRNA3', или GSP може да биде дизајниран да се анулира низводно со прајмерот за обратно засилување.За некои засилени објекти, неопходно е да се дизајнираат повеќе од еден антисенс прајмер за успешна RT-PCR бидејќи секундарната структура на целната РНК може да го спречи врзувањето на прајмерот.Се предлага да се користи 1pmol antisense GSP во првиот систем за синтеза на синтеза на синтеза од 20μl.

2. Зголемете ја температурата на зачувување на топлина на обратна транскрипција:

За целосно искористување на специфичноста на GSP, треба да се користи реверзна транскриптаза со висока термичка стабилност.Реверзна транскриптаза стабилна на топлина може да се изолира на повисоки температури за да се зголеми строгоста на реакцијата.На пример, ако GSP се анулира на 55°C, тогаш специфичноста на GSP не е целосно искористена ако обратната транскрипција се изведува на 37°C со мала строгост користејќи AMV или M-MLV.Сепак, SuperScripⅡ и ThermoScript можат да реагираат на 50℃ или повисока, што ги елиминира неспецифичните производи произведени на пониски температури.За максимална специфичност, смесата РНК/прајмер може да се пренесе директно од температурата на денатурација од 65℃ до температурата на задржување на обратна транскрипција со додавање на претходно загреана 2 x реакциона смеса (термичко започнување на синтезата на cDNA).Ова помага да се спречи спарувањето на базите помеѓу молекулите при ниски температури.Користењето на PCR инструмент ги поедноставува многуте температурни транзиции потребни за RT-PCR.

3. Намалете ја контаминацијата на геномската ДНК:

Една потенцијална тешкотија со RT-PCR е тоа што РНК ја контаминира геномската ДНК.Употребата на подобри методи за сепарација на РНК, како што е реагенсот Тризол, ја намалува контаминацијата на геномската ДНК во препаратите со РНК.За да се избегнат производи произведени од геномска ДНК, РНК може да се третира со DnasⅠ степен на засилување за да се отстрани контаминираната ДНК пред обратна транскрипција.Примероците беа чувани на 65℃ во 2.0mM EDTA 10 минути за да се прекине дигестијата на DNaseⅠ.EDTA хелатира јони на магнезиум за да ја спречи хидролизата на РНК зависна од магнезиум јони што се случува на високи температури.

Со цел да се оддели засилената cDNA од производот за амплификација на ДНК на геномот, може да се дизајнираат прајмери ​​кои одделно се анектираат со одвоениот егзон.Производите на PCR добиени од cDNA ќе бидат пократки од оние добиени од контаминирана геномска ДНК.Контролиран експеримент без обратна транскрипција исто така се изведува на секој шаблон на РНК за да се утврди дали даден фрагмент е од геномска ДНК или cDNA.PCR производите добиени во отсуство на обратна транскрипција се добиени од геномот.

Поврзан производ

RT-PCR Лесно^ᵀᴹЈас (Еден чекор)

-Комплетот во еден чекор овозможува обратна транскрипција и PCR да се вршат во истата цевка.Треба само да додаде шаблон РНК, специфични ПЦР прајмери ​​и ddH без RNase₂O.

-Квантитативната анализа на РНК во реално време може да се изврши брзо и прецизно.

- Комплетот користи уникатен Foregene реагенс за обратна транскрипција и Foregene HotStar Taq DNA полимераза во комбинација со уникатен систем за реакција за ефикасно подобрување на ефикасноста на засилување и специфичноста на реакцијата.

-Оптимизираниот систем за реакција прави реакцијата да има поголема чувствителност за откривање, посилна термичка стабилност и подобра толеранција.

RT Easy II (со GDNase) Главен премикс за синтеза на CDNA од прво влакно за PCR во реално време со GDNase

-Ефикасна способност за отстранување на gDNA, што може да ја отстрани gDNA во шаблонот во рок од 2 минути.

-Ефикасен систем за обратна транскрипција, потребни се само 15 минути за да се заврши синтезата на првата нишка cDNA.

-Сложени шаблони: шаблоните со висока содржина на GC и сложена секундарна структура, исто така, може да се менуваат со висока ефикасност.

-Систем за обратна транскрипција со висока чувствителност, шаблоните на ниво на pg може да добијат и висококвалитетна cDNA.

- Системот за обратна транскрипција има висока термичка стабилност, оптималната температура на реакцијата е 42℃, а сепак има добри перформанси на обратна транскрипција на 50℃.