Како нов во лабораторијата, не е добра работа да се отстранат позитивните растенија од куп растенија со ниска стапка на конверзија.Прво, ДНК мора да се извлече од голем број примероци еден по еден, а потоа странските гени ќе бидат откриени со PCR.Сепак, резултатите често се празни и ленти со неколку ставки повремено, но невозможно е да се утврди дали има пропуштени или лажни откривања..Дали е многу беспомошно да се соочиш со таков експериментален процес и резултати?Не грижете се, брат ве учи како лесно и прецизно да ги прегледате трансгенските позитивни растенија.

Чекор 1

Прајмери ​​за откривање дизајн

Одредете го ендогениот ген и егзогениот ген што треба да се детектираат според примерокот што треба да се тестира и изберете репрезентативна секвенца од 100-500 bp во генот за дизајн на прајмер.Добрите прајмери ​​можат да обезбедат точност на резултатите од откривањето и да го скратат времето на откривање (видете го додатокот за најчесто користените прајмери ​​за откривање).

Забелешка: Новодизајнираните прајмери ​​треба да ги оптимизираат условите на реакцијата и да ја потврдат точноста, прецизноста и границата на откривање на откривањето пред откривање од големи размери.

Чекор 2

Дизајн на експериментален протокол

Позитивна контрола: Користете ја прочистената ДНК што го содржи целниот фрагмент како шаблон за да одредите дали системот и условите за реакција на PCR се нормални.

Негативна/празна контрола: Користете го образецот на ДНК или ddH2O што не го содржи целниот фрагмент како шаблон за да откриете дали има извор на контаминација во PCR системот.

Внатрешна референтна контрола: користете ја комбинацијата на прајмер/сонда на ендогениот ген на примерокот што треба да се тестира за да се оцени дали шаблонот може да се открие со PCR.

Забелешка:

За секој тест треба да се постават позитивни, негативни/празни контроли и контроли за внатрешна контрола за да се оцени валидноста на експерименталните резултати.

Подготовка за експеримент

Пред употреба, погледнете дали растворот е рамномерно измешан.Доколку се најдат врнежи, тие треба да се растворат и измешаат според упатствата пред употреба.2×PCR мешавината треба да се пипетира и постојано да се меша со микропипета пред употреба за да се избегне нерамномерна дистрибуција на јони.

Забелешка:

Извадете го упатството и внимателно прочитајте го и подгответе се пред експериментот во строга согласност со барањата на прирачникот.

Чекор 4

Подгответе PCR систем за реакција

Според експерименталниот протокол, рамномерно измешајте ги прајмерите, H2O и 2×PCR, центрифугирајте и распоредете ги на секоја реакциона цевка.

Забелешка:

За големи или долгорочно тестирање, се препорачува да се користи систем за реакција на PCR кој содржи ензим UNG, кој може ефикасно да избегне контаминација на аеросол предизвикана од производите на PCR.

Чекор 5

Додадете шаблон за реакција

Користејќи ја технологијата Direct PCR, нема потреба од мачен процес на прочистување на нуклеинската киселина, образецот на примерокот може да се подготви во рок од 10 минути и да се додаде соодветниот систем за реакција на PCR.

Забелешка:

Методот на расцепување има подобар ефект на откривање, а добиениот производ може да се користи за повеќекратни реакции за откривање.

5.1: Директно проширување на листовите

Според големината на сликата во упатството, исечете го листовото ткиво со дијаметар од 2-3 mm и ставете го во системот за реакција на PCR.

Забелешка: Осигурете се дека фрагментите од листот се целосно потопени во растворот за реакција на PCR и не додавајте прекумерно ткиво на листот.

5.2: Метод на разделување на листовите

Исечете го лисното ткиво со дијаметар од 5-7 mm и ставете го во цевка за центрифуга.Ако изберете зрели лисја, избегнувајте да ги користите ткивата на главната вена на листот.Пипетирајте 50 ul пуфер P1 лизат во цевка со центрифуга за да се осигурате дека лизатот може целосно да го потопи ткивото на листот, ставете го во термички циклус или метална бања и лиза на 95°C 5-10 минути.

Додадете 50 ул. раствор за неутрализација на пуфер P2 и добро измешајте.Добиениот лизат може да се користи како шаблон и да се додаде во системот за реакција на PCR.

Забелешка: Количеството на шаблонот е помеѓу 5-10% од PCR системот и не треба да надминува 20% (на пример, во PCR систем од 20μl, додадете 1-2μl раствор за лиза, не повеќе од 4μl).

Чекор 6

PCR реакција

По центрифугирање на PCR реакционата цевка, таа се става во PCR инструмент за засилување.

Забелешка:

Реакцијата користи непрочистен шаблон за засилување, така што бројот на циклуси на засилување е 5-10 циклуси повеќе отколку кога се користи шаблон за прочистена ДНК.

Чекор 7

Откривање на електрофореза и анализа на резултатите

М: 100bp ДНК скалила

1\4: Метод на прочистена ДНК

2\5: Директен метод на PCR

3\6: Празно контрола

КК:

Резултатите од тестот на различните контроли поставени во експериментот треба да ги исполнуваат следните услови.Во спротивно, треба да се анализира причината за проблемот, а тестот да се направи повторно откако ќе се отстрани проблемот.

Табела 1. Нормални резултати од тестот на различни контролни групи

*Кога плазмидот се користи како позитивна контрола, резултатот од тестот за ендогени гени може да биде негативен

Пресуда на резултатот:

A. Резултатот од тестот на ендогениот ген на примерокот е негативен, што покажува дека ДНК погодна за обична PCR детекција не може да се екстрахира од примерокот или екстрахираната ДНК содржи инхибитори на PCR реакција, и ДНК треба повторно да се екстрахира.

Б. Резултатот од тестот на ендогениот ген на примерокот е позитивен, а резултатот од тестот на егзогениот ген е негативен, што покажува дека од примерокот е извлечена ДНК погодна за обична PCR детекција и може да се процени дека генот ХХХ не е откриен во примерокот.

В. Резултатот од тестот на ендогениот ген на примерокот е позитивен, а резултатот од тестот на егзогениот ген е позитивен, што покажува дека од примерокот е извлечена ДНК погодна за обична PCR детекција, а примерокот ДНК го содржи генот ХХХ.Експериментите за потврда може дополнително да се спроведат.

Чекор 8

Прајмери ​​за откривање дизајн

По експериментот, користете 2% раствор на натриум хипохлорит и 70% раствор на етанол за да ја избришете експерименталната област за да спречите загадување на животната средина.