RT-qPCR е развиен од обична PCR технологија.Додава флуоресцентни хемикалии (флуоресцентни бои или флуоресцентни сонди) на традиционалниот систем за реакција на PCR и го открива процесот на жарење и продолжување на PCR во реално време според нивните различни луминисцентни механизми.Промените на флуоресцентниот сигнал во медиумот се користат за пресметување на количината на промена на производот во секој циклус на PCR.Во моментов, најчестите методи се методот на флуоресцентна боја и методот на сонда.

Метод на флуоресцентна боја:
Некои флуоресцентни бои, како што се SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, итн., не испуштаат светлина сами по себе, туку испуштаат флуоресценција по врзувањето за малиот жлеб на dsDNA.Затоа, на почетокот на реакцијата на PCR, машината не може да го открие флуоресцентниот сигнал.Кога реакцијата продолжува до фазата на жарење-продолжување (метод во два чекора) или фаза на продолжување (метод во три чекори), двојните нишки се отвораат во тоа време и новата ДНК полимераза За време на синтезата на веригата, флуоресцентните молекули се комбинираат во помалиот жлеб dsDNA и емитуваат флуоресценција.Како што се зголемува бројот на циклуси на PCR, се повеќе и повеќе бои се комбинираат со dsDNA, а флуоресцентниот сигнал исто така постојано се подобрува.Земете го SYBR Green Ⅰ како пример.
Метод на сонда:
Сондата Taqman е најчесто користена сонда за хидролиза.Има флуоресцентна група на 5' крајот на сондата, обично FAM.Самата сонда е секвенца комплементарна на целниот ген.Постои флуоресцентна група за гаснење на 3' крајот на флуорофорот.Според принципот на пренос на енергија на флуоресцентна резонанца (Ферстер трансфер на енергија на резонанца, FRET), кога флуоресцентната група известувач (флуоресцентна молекула донор) и флуоресцентната група за гаснење (акцепторна флуоресцентна молекула) Кога спектарот на возбуда се преклопува и растојанието од 7-10 е многу блиску. флуоресценција на акцепторната молекула, додека автофлуоресценцијата е ослабена.Затоа, на почетокот на реакцијата на PCR, кога сондата е слободна и недопрена во системот, репортерската флуоресцентна група нема да емитува флуоресценција.При жарење, прајмерот и сондата се врзуваат за шаблонот.За време на фазата на продолжување, полимеразата континуирано синтетизира нови синџири.ДНК полимеразата има 5'-3' егзонуклеазна активност.Кога ќе стигне до сондата, ДНК полимеразата ќе ја хидролизира сондата од шаблонот, ќе ја оддели репортерната флуоресцентна група од флуоресцентната група за гаснење и ќе го ослободи флуоресцентниот сигнал.Бидејќи постои врска еден-на-еден помеѓу сондата и шаблонот, методот на сонда е супериорен во однос на методот на боја во однос на точноста и чувствителноста на тестот.

Сл. 1 Принцип на qRT-PCR

Дизајн на прајмер
Принципи:

Прајмерите треба да бидат дизајнирани во зачуваниот регион од серијата на нуклеинска киселина и да имаат специфичност.

Најдобро е да се користи cDNA секвенца, а секвенцата на mRNA е исто така прифатлива.Ако не, дознајте го дизајнот на регионот на ЦД-ата на секвенцата на ДНК.
Должината на флуоресцентниот квантитативен производ е 80-150bp, најдолгата е 300bp, должината на прајмерот е генерално помеѓу 17-25 бази, а разликата помеѓу прајмерите нагоре и низводно не треба да биде премногу голема.

Содржината на G+C е помеѓу 40% и 60%, а 45-55% е најдобра.
Вредноста на ТМ е помеѓу 58-62 степени.
Обидете се да избегнете димери и самодимери на прајмер, (не се појавуваат повеќе од 4 пара последователни комплементарни основи) структурата на фиба, доколку е неизбежна, направете ΔG<4,5 kJ/mol* Ако не можете да се уверите дека gDNA е отстранета за време на обратна транскрипција Чисто, најдобро е да ги дизајнирате прајмерите на *3, крајниот регион, да се избегнат модифицирани, краеви на G. /C, A/G континуирана структура (2-3) прајмери ​​и не-
специфична Хомологијата на хетерогено засилената низа е по можност помала од 70% или има 8 комплементарни базни хомологија.
База на податоци:
Пребарување CottonFGD по клучни зборови
Дизајн на прајмер:
Дизајн на прајмер IDT-qPCR

Fig2 IDT страница со алатки за онлајн дизајн на прајмер

Сл.3 Приказ на страница со резултати
Дизајн на lncRNA прајмери:
lncRNA:истите чекори како mRNA.
miRNA:Принципот на методот stem-loop: Бидејќи сите miRNA се кратки секвенци од околу 23 nt, директното откривање на PCR не може да се изврши, па затоа се користи алатката за секвенца на стебло-јамка.Секвенцата на стебло-јамка е едноверижна ДНК од околу 50 nt, која може сама да формира структура на фиба.3 'Крајот може да се дизајнира како секвенца комплементарна на парцијалниот фрагмент на miRNA, потоа целната miRNA може да се поврзе со низата на стебло-јамка за време на обратна транскрипција, а вкупната должина може да достигне 70 bp, што е во согласност со должината на засилениот производ одредена со qPCR.Дизајн на прајмер за опашка miRNA .
Откривање специфично за засилување:
Онлајн база на податоци за експлозија: CottonFGD експлозија по сличност со низа
Локална експлозија: погледнете ја употребата на Blast+ за да се изврши локална експлозија, Linux и macos можат директно да воспостават локална база на податоци, системот win10 може да се направи и по инсталирањето на Ubuntu bash.Креирајте локална база на податоци за експлозија и локална експлозија;отворете го Ubuntu bash на win10.
Забелешка: Висинскиот памук и морски островски памук се тетраплоидни култури, така што резултатот од експлозијата често ќе биде два или повеќе натпревари.Во минатото, користењето на NAU-cds како база на податоци за извршување на експлозијата веројатно ќе најде два хомологни гени со само неколку SNP разлики.Обично, двата хомологни гени не можат да се разделат со дизајн на прајмер, па затоа се третираат како исти.Ако има очигледен индел, прајмерот обично се дизајнира на инделот, но тоа може да доведе до секундарна структура на прајмерот. Слободната енергија станува поголема, што доведува до намалување на ефикасноста на засилување, но тоа е неизбежно.

Откривање на секундарна структура на прајмер:
Чекори:отворете го олиго 7 → низа на влезен шаблон → затворете го подпрозорецот → зачувајте → лоцирајте го прајмерот на шаблонот, притиснете ctrl+D за да ја поставите должината на прајмерот → анализирајте различни секундарни структури, како што се самодимеризациско тело, хетеродимер, фиба, неусогласеност итн. Последните две слики на Слика 4 се резултатите од тестот на прајмерот.Резултатот од предниот прајмер е добар, нема очигледна структура на димер и фиба, нема континуирани комплементарни основи, а апсолутната вредност на слободната енергија е помала од 4,5, додека задниот прајмер покажува континуирано 6-те основи се комплементарни, а слободната енергија е 8,8;дополнително, на крајот од 3′ се појавува посериозен димер и се појавува димер од 4 последователни основи.Иако слободната енергија не е висока, 3′ димерот Chl може сериозно да влијае на специфичноста на засилувањето и ефикасноста на засилувањето.Покрај тоа, неопходно е да се провери дали има шноли, хетеродимери и несовпаѓање.

Резултати од откривање на Fig3 oligo7
Откривање на ефикасност на засилување:
Ефикасноста на засилување на PCR реакцијата сериозно влијае на резултатите од PCR.Исто така кај qRT-PCR, ефикасноста на засилување е особено важна за квантитативните резултати.Отстранете ги другите супстанции, машини и протоколи во пуферот за реакција.Квалитетот на прајмерите исто така има големо влијание врз ефикасноста на засилување на qRT-PCR.За да се обезбеди точност на резултатите, и релативната квантификација на флуоресценција и апсолутната флуоресценција квантификација треба да ја детектираат ефикасноста на засилување на прајмерите.Признаено е дека ефективната ефикасност на засилување qRT-PCR е помеѓу 85% и 115%.Постојат два методи:
1. Стандарден метод на крива:
а.Измешајте cDNA
б.Градиент разредување
c.qPCR
г.Линеарна регресивна равенка за пресметување на ефикасноста на засилување
2. LinRegPCR
LinRegPCR е програма за анализа на RT-PCR податоци во реално време, наречени и квантитативни PCR (qPCR) податоци базирани на SYBR Green или слична хемија.Програмата користи неосновни корегирани податоци, врши корекција на основната линија на секој примерок одделно, одредува прозорец на линеарност и потоа користи линеарна регресивна анализа за да се вклопи права линија низ множеството податоци на PCR.Од наклонот на оваа линија се пресметува ефикасноста на PCR на секој поединечен примерок.Просечната ефикасност на PCR по ампликон и вредноста на Ct по примерок се користат за пресметување на почетната концентрација по примерок, изразена во произволни флуоресцентни единици.Внесувањето и излезот на податоците се преку табела на Excel.Само примерок
потребно е мешање, без градиент
потребни се чекори:(Земете го Bole CFX96 како пример, не сосема машина со јасна ABI)
експеримент:тоа е стандарден qPCR експеримент.
qPCR излез на податоци:LinRegPCR може да препознае две форми на излезни датотеки: RDML или квантификација Резултат од засилување.Всушност, тоа е вредноста за откривање во реално време на бројот на циклусот и флуоресцентниот сигнал од машината, а засилувањето се добива со анализа на вредноста на промената на флуоресценцијата на ефикасноста на линеарниот сегмент.
Избор на податоци: Во теорија, вредноста RDML треба да биде употреблива.Се проценува дека проблемот на мојот компјутер е што софтверот не може да препознае RDML, па ја имам излезната вредност на excel како оригинален податок.Се препорачува прво да се изврши груб скрининг на податоците, како што е неуспехот на додавање примероци итн. Точките може да се избришат во излезните податоци (се разбира, не можете да ги избришете, LinRegPCR ќе ги игнорира овие точки во подоцнежната фаза)

Слика 5 qPCR извоз на податоци

Сл6 избор на примероци кандидати

Внесување податоци:Отворете резултати од засилување на квалификациите.xls, → отворете LinRegPCR → датотека → прочитајте од Excel → изберете параметри како што е прикажано на Слика 7 → OK → кликнете на одредување на основни линии

Сл7 чекори на внесување податоци linRegPCR

Резултат:Ако нема повторување, не е потребно групирање.Ако има повторување, групирањето може да се уредува во групирањето примероци, а името на генот се внесува во идентификаторот, а потоа истиот ген автоматски ќе се групира.Конечно, кликнете на датотеката, извезете ексел и погледнете ги резултатите.Ќе се прикажат ефикасноста на засилување и R2 резултатите на секој бунар.Второ, ако се поделите во групи, ќе се прикаже поправената просечна ефикасност на засилување.Осигурете се дека ефикасноста на засилување на секој прајмер е помеѓу 85% и 115%.Ако е премногу голем или премногу мал, тоа значи дека ефикасноста на засилување на прајмерот е слаба.

Сл. 8 Резултат и излез на податоци

Експериментален процес:
Барања за квалитет на РНК:
Чистота:1.72.0 покажува дека може да има резидуален изотиоцијанат.Чистата нуклеинска киселина A260/A230 треба да биде околу 2 . Ако има силна апсорпција на 230 nm, тоа покажува дека има органски соединенија како што се фенат јони.Покрај тоа, може да се открие со 1,5% електрофореза со гел агароза.Посочете го маркерот, бидејќи ssRNA нема денатурација и логаритамот на молекуларната тежина нема линеарна врска, а молекуларната тежина не може правилно да се изрази.Концентрација: Теоретскинепомалку од 100ng/ul, ако концентрацијата е премногу ниска, чистотата е генерално ниска не висока

Сл9 РНК гел

Дополнително, ако примерокот е скапоцен, а концентрацијата на РНК е висока, се препорачува да се аликвотира по екстракцијата и да се разреди РНК до конечна концентрација од 100-300 ng/ul за обратна транскрипција.Вопроцесот на обратна транскрипција, кога се транскрибира mRNA, олиго (dt) прајмери ​​кои можат специфично да се врзат за опашките на polyA се користат за обратна транскрипција, додека lncRNA и circRNA користат случаен хексамер (Случаен 6 mer) прајмери ​​за обратна транскрипција на вкупната РНК За miRNA, miRNA-специфичните прајмери ​​се користат за reck-loopverse transcription.Многу компании сега лансираа специјални комплети за јаловина.За методот на матични јамки, методот на опашка е попогоден, повисок пропусен и заштедува реагенс, но ефектот на разликување на miRNA од исто семејство не треба да биде толку добар како методот на стебла-јамка.Секој комплет за обратна транскрипција има барања за концентрација на ген-специфични прајмери ​​(стебло-јамки).Внатрешната референца што се користи за miRNA е U6.Во процесот на инверзија на стебло-јамка, цевката од U6 треба да се преврти посебно, а предните и задните прајмери ​​на U6 треба директно да се додадат.И circRNA и lncRNA можат да користат HKG како внатрешна референца.Вооткривање на cDNA,
ако нема проблем со РНК, и cDNA би требало да е во ред.Меѓутоа, ако се следи совршенството на експериментот, најдобро е да се користи внатрешен референтен ген (Референтен ген, RG) кој може да разликува gDNA од cds.Генерално, RG е ген за домаќинство., HKG) како што е прикажано на Слика 10;Во тоа време, правев протеин за складирање на соја и користев интрони што содржи актин7 како внатрешна референца.Големината на засилениот фрагмент од овој прајмер во gDNA беше 452bp, а ако cDNA се користеше како шаблон, таа беше 142bp.Потоа резултатите од тестот открија дека дел од cDNA всушност е контаминиран со gDNA, а исто така докажа дека нема проблем со резултатот од обратна транскрипција и може да се користи како шаблон за PCR.Бескорисно е да се спроведе електрофореза со гел агароза директно со cDNA, а тоа е дифузна лента, што не е убедливо.

Сл. 10 Откривање на cDNA

Одредување на qPCR условигенерално нема проблем според протоколот на комплетот, главно во чекорот на вредноста tm.Ако некои прајмери ​​не се добро дизајнирани за време на дизајнот на прајмерот, што резултира со голема разлика помеѓу вредноста tm и теоретските 60°C, се препорачува cDNA Откако ќе се измешаат примероците, да се изврши градиентна PCR со прајмери ​​и обидете се да избегнете поставување на температурата без ленти како TM вредност.

Анализа на податоци

Конвенционалниот метод на обработка со релативна флуоресценција квантитативна PCR во основа е според 2-ΔΔCT.Шаблон за обработка на податоци.

Поврзани производи:

Лесно PCR во реално време^TM – Такман

Лесно PCR во реално време^TM – SYBR GREEN I

RT Easy I (Главен премикс за синтеза на cDNA на првата жичка)

RT Easy II (Главниот премикс за синтеза на cDNA на првата жичка за qPCR)