Сите зборуваат за принципот на qRT-PCR експеримент, дизајн на прајмер, интерпретација на резултатите итн., но мислам дека треба да го споделам со вас експерименталната работа на qRT-PCR.Мал е, но се работи за резултати.
Пред да направиме qRT-PCR, треба да имаме јасно разбирање за нашата сопствена РНК и оперативните методи.На крајот на краиштата, нашите напори се насочени кон постигнување резултати, наместо едноставно да вежбаме.Значи, пред да направиме qRT-PCR, треба да ги одредиме следните проблеми (од кои некои се применливи само за SYBR).
1 Дали сте сигурни дека вашата РНК не е деградирана?
NanoDrop 2000 може да ја открие само концентрацијата и чистотата на РНК, но не може да го открие интегритетот на РНК.
Вредноста на RNA (RNA Intesity Number) може да го рефлектира интегритетот на РНК, кој е откриен од системот Agilent 2100 Bioanalyzer.
Сл. Шематски дијаграм на вредностите на RIN за различни примероци на РНК (еукариоти)
Сепак, лабораториите генерално немаат Agilent 2100 Bioanalyzer.Во овој случај, можеме да откриеме преку формалдехид гел, но потребата за вкупната количина на РНК е висока, па затоа најбрзиот метод е да се користи обична гел електрофореза.Потребно е да се наоѓа во средина без нуклеаза, затоа е неопходно да се исплакне резервоарот за електрофореза, шишето со раствор, држачот за гел и да се чешла со вода DEPC.Агарозата исто така е без нуклеаза (додека е свежо отворена), а Loading Buffer треба да биде свежо отворен што е можно повеќе, со 1,2% гел.
Забележете дека гелот мора целосно да се раствори, инаку ќе предизвика нехомогени ленти, како што е прикажано на примерокот 9 на сликата.Ако напонот е превисок или работи предолго, ќе генерира топлина и ќе предизвика деградација на РНК, така што напонот и времето треба да се контролираат разумно.Дополнително, работата со гел може дополнително да одреди дали има остатоци од ДНК во примерокот и да набљудува дали има голем број задржани ленти во бунарот за издавање.
Слика.Гел електрофореза откривање на РНК
2 Дали сте сигурни за концентрацијата на вашата cDNA?
Искуството на големите браќа во лабораторијата е дека cDNA на системот 20 ul добиен со секоја инверзија директно се разредува 20X, додека сестрите по докторат се разредуваат 10X.Обично зависам од ситуацијата.Бидејќи квалитетот на РНК спомнат од секој човек е различен, нивото на повртување е исто така различно, а технологијата на превртување може да не е стабилна.
Така, секој пат кога ќе ја добијам обратната cDNA, прво ќе ја разредувам околу 3 пати, а потоа ќе го користам генот за домаќинство за да направам RT-PCR, бројот на циклуси е генерално 25 циклуси, за да се идентификува специфичната концентрација, а потоа да се одреди финалниот фактор на разредување.
3 Дали сте сигурни дека вашите прајмери се лесни за употреба?
Може да ја помине кривата на топење на qRT-PCR, но тоа сепак чини пари.За лаборатории без многу пари, кога ќе добијат многу прајмери, можат да користат обичен RT-PCR за да видат дали е единечна лента и да ја идентификуваат специфичноста на прајмерите.Ако на лабораторијата не и недостигаат пари, специфичноста на сите прајмери може да се идентификува еднаш преку кривата на топење.
4 Дали сте сигурни дека вашите експериментални услови се соодветни?
SYBR треба да биде заштитен од силна светлина, затоа обидете се да го исклучите надземното светло кога додавате SYBR реагенс и треба само да користите слабо светло за да го комплетирате.
Да се чува SYBR на 4°C.Кога го користите, нежно превртете го нагоре и надолу за добро да се измеша за да избегнете пена и немојте силно да виртуелизирате.
Некои помлади сестри сакаат да цртаат ознаки на PCR таблата поради страв да не ги измешаат примероците, што е погрешно.Бидејќи вашите маркери многу веројатно ќе влијаат на собирањето флуоресцентни сигнали, генерално им препорачувам на помладите да користат експериментални тетратки за да помогнат во меморијата, како што е прикажано подолу.
Слика.qRT-PCR дијаграм за вчитување примерок
5 Дали сте сигурни дека го правите тоа правилно?
Бидете сигурни да носите ракавици, да носите ракавици, да носите ракавици и да кажете важни работи три пати.
Со цел да се намали изложеноста на SYBR на светлина, јас лично сакам прво да додадам образец, како што е прикажано на сликата подолу.Според искуството, додавањето на мала количина шаблон веројатно ќе предизвика грешки при земање примероци.Затоа, со цел да се минимизира грешката предизвикана од додавање на мала количина на шаблон, обично го удвојувам примерокот повторно и го удвојувам количеството кога го додавам примерокот за да ја намалам количината на додаден H2O2.
Слика.Шематски дијаграм на вчитување на qRT-PCR
Потоа конфигурирајте го qRT-PCR системот на следниов начин.
Слика.Дијаграм за подготовка на системот qRT-PCR
ЗАБЕЛЕШКА: Процесот на конфигурација треба да се направи на мраз.
По додавањето на примерокот, залепете го проѕирниот филм за запечатување.Обидете се да не ја допирате површината на проѕирната фолија за заптивање со рацете, само работете од просторот од двете страни на филмот.Бидејќи отпечатоците од прсти може да влијаат и на собирањето флуоресцентни сигнали.Потоа користете центрифуга за брзо центрифугирање 10 секунди со мала брзина за да спречите да виси примерокот на ѕидот.
Поврзани производи:
Време на објавување: Април-28-2023
