СОВИД-19 е заразна болест предизвикана од Тежок акутен респираторен синдром Коронавирус тип 2. Кога некое лице е заразено, најчестите симптоми вклучуваат треска, кашлица и отежнато дишење.

Примероците што се користат за тестирање може да се соберат со назофарингеални брисеви или орофарингеални брисеви.

Што е PCR?

Стандардниот метод за откривање на коронавирус е полимеразна верижна реакција, PCR.Ова е метод кој широко се користи во молекуларната биологија.Може брзо да копира милиони до милијарди специфични фрагменти на ДНК.

Новиот коронавирус содржи многу долг едноверижен РНК геном.Со цел да се детектираат овие вируси со PCR, молекулите на РНК мора да се конвертираат во нивните комплементарни ДНК секвенци со реверзна транскриптаза, а потоа новосинтетизираната ДНК може да се засили со стандардни PCR процедури, што е вообичаено познато како RT-PCR.

RT-PCR процес

Екстракција на РНК

За да се изврши овој метод, во основа треба да се екстрахира вирусна РНК.Различни комплети за прочистување на РНК може да се користат за практично, брзо и ефективно раздвојување.

За да се извлече вирусна РНК со помош на комерцијален комплет, прво додајте го примерокот во цевка со микроцентрифуга, а потоа измешајте го со пуферот за лиза.Овој пуфер е високо денатуриран и обично се состои од фенол и гванидин изотиоцијанат.Покрај тоа, инхибиторите на RNase обично се присутни во пуферот за лиза за да се обезбеди изолација на недопрена вирусна РНК.

По додавањето на пуферот за лиза, извиткувајте ја цевката за мешање со пулс и инкубирајте на собна температура.Вирусот потоа се лизира под високо денатурирани услови обезбедени од пуферот за лиза.

Откако примерокот е лизиран, се користи цевка за центрифуга за постапката на прочистување.Примерокот се става во цевката за центрифуга и потоа се центрифугира.

Оваа постапка е метод на екстракција на цврста фаза во која стационарната фаза се состои од матрица од силика гел.

Под оптимални услови на сол и pH, молекулите на РНК се врзуваат за силициумската мембрана.

Во исто време, протеините и другите загадувачи се отстрануваат.

По центрифугирањето, ставете ја цевката за центрифугирање во чиста цевка за собирање, фрлете го филтратот и потоа додадете пуфер за перење.

Повторно ставете ја цевката во центрифугата за да го натерате пуферот за миење низ мембраната.Ова ќе ги отстрани сите преостанати нечистотии од мембраната, оставајќи ја само РНК врзана за силика гелот.

Откако ќе се измие примерокот, ставете ја цевката во чиста цевка за микроцентрифуга и додадете го пуферот за елуција.

Потоа се центрифугира за да го принуди пуферот за елуција низ мембраната.Елуциониот пуфер ја отстранува вирусната РНК од спин колоната и добива прочистена РНК без протеини, инхибитори и други загадувачи.

ЧЕКОР 2

Мешан концентрат

По екстракција на вирусната РНК, следниот чекор е да се подготви реакционата смеса за PCR засилување.Во овој чекор, се користи концентрат.Овој концентриран раствор е претходно измешан концентриран раствор кој се состои од премикс, обратна транскриптаза, нуклеотиди, напреден прајмер, обратен прајмер, сонда TaqMan и ДНК полимераза.

Конечно, за да се заврши оваа реакциона смеса, се додава шаблонот РНК.Цевките се мешаат со пулсен вртлог, а потоа реакционата смеса се вчитува во ПЦР плочата.ПЦР плочата обично содржи 96 бунари и може да анализира повеќе примероци во исто време.

ЧЕКОР 3

PCR засилување

Следно, ставете ја плочата во машината за PCR, која во суштина е термички циклус.

RT-PCR во реално време се користи за откривање на новиот коронавирус од 2019 година со засилување на целната секвенца во генот RdrRP, генот Е и генот N.Изборот на целниот ген зависи од прајмерот и секвенцата на сондата.

Првиот чекор на RT-PCR е обратна транскрипција.Се синтетизира првата нишка на комплементарна ДНК, која се иницира со PCR реверзниот прајмер, кој се врзува за комплементарниот дел од геномот на вирусната РНК.Потоа, реверзната транскриптаза додава ДНК нуклеотиди на 3'-крајот на прајмерот за да синтетизира ДНК комплементарна на вирусната РНК.Температурата и времетраењето на овој чекор зависат од прајмерите, целната РНК и реверзната транскриптаза што се користат.

Следно, се применува иницијален чекор на денатурација, што резултира со денатурација на хибридот РНК-ДНК.Овој чекор е неопходен за активирање на ДНК полимеразата.Во исто време, реверзната транскриптаза е инактивирана.

PCR се состои од серија термички циклуси.Секој циклус се состои од чекори на денатурација, жарење и продолжување.

Чекорот на денатурација вклучува загревање на комората за реакција на 95 степени Целзиусови и нејзино користење за денатурација на двоверижна ДНК шаблон.

Во следниот чекор, температурата на реакцијата се намалува на 58 степени Целзиусови, дозволувајќи му на напредниот прајмер да се анектира до комплементарниот дел од неговата едноверижна ДНК шаблон.Температурата на жарење директно зависи од должината и составот на прајмерот.

Во чекорот на продолжување, ДНК полимеразата синтетизира нова ДНК влакно што е комплементарна со нишката на шаблонот на ДНК.Со додавање на слободни јадра комплементарни на шаблонот во насока 5' до 3' од реакционата смеса.Температурата на овој чекор зависи од употребената ДНК полимераза.

По првиот циклус се добива двоверижна цел на ДНК.

Потоа, внесете го вториот циклус.Двоверижната ДНК е денатурирана за да произведе две едноверижни ДНК молекули.

Во следниот чекор, температурата на реакцијата се намалува, прајмерите се анектираат на секој шаблон со едноверижна ДНК, а сондата Taq-man се анелира до комплементарниот дел од целната ДНК.

Сондата TaqMan се состои од флуорофор ковалентно поврзан со 5' крајот на олигонуклеотидната сонда.Кога е возбуден од изворот на светлина на циклерот, флуорофорот емитува флуоресценција.Покрај тоа, сондата е составена од гаснење на 3'крајот.Близината на генот известувач до гаснечот го спречува откривањето на флуоресценцијата.

Во чекорот на продолжување, ДНК полимеразата синтетизира нова нишка.Кога полимеразата ќе стигне до сондата TaqMan, нејзината ендогена активност на 5'нуклеаза ја расцепува сондата, одвојувајќи ја бојата од гаснечот.

Со секој циклус на PCR, се ослободуваат повеќе молекули на боја, што резултира со зголемување на интензитетот на флуоресценцијата пропорционално на бројот на синтетизирани ампликони.

Овој метод овозможува да се процени бројот на дадена низа присутна во примерокот.Бројот на двоверижни фрагменти на ДНК се удвојува во секој циклус.Затоа, PCR може да се користи за анализа на многу мали примероци.

За мерење на флуоресцентен сигнал, волфрамово халогена светилка, филтер за возбудување, рефлектор, леќа, филтер за емисија и CCD камера поврзана со полнење.

ЧЕКОР 4 Откријте

За мерење на флуоресцентен сигнал, волфрамово халогена светилка, филтер за возбудување, рефлектор, леќа, филтер за емисија и CCD камера поврзана со полнење.

Филтрираната светлина од светилката се рефлектира од рефлекторот, поминува низ леќата на кондензаторот и се фокусира на центарот на секоја дупка.Потоа флуоресценцијата што се испушта од дупката се рефлектира од огледалото, поминува низ филтерот за емисија и се открива од CCD камерата.Во секој PCR циклус, само-возбудената флуорофорна светлина може да се открие со CCD.

Ја претвора заробената светлина во дигитални податоци.Овој метод се нарекува PCR во реално време и овозможува следење во реално време на напредокот на PCR реакцијата.