PCR (полимеразна верижна реакција) е една од технологиите за ин-витро засилување на ДНК, со историја од повеќе од 30 години.

PCR технологијата беше пионерска од Кари Мулис од Цетус, САД во 1983 година. Малис аплицираше за патент за ПЦР во 1985 година и го објави првиот академски труд за ПЦР за Наука во истата година.Мулис беше награден со Нобеловата награда за хемија во 1993 година за неговата работа.

Основни принципи на PCR

PCR може да ги засили целните фрагменти на ДНК за повеќе од еден милион пати.Принципот е под катализа на ДНК полимераза, со користење на ДНК од матичната нишка како шаблон и специфичен прајмер како почетна точка за проширување.Се реплицира ин витро преку чекори како што се денатурација, жарење и екстензија.Процесот на ДНК од ќеркичка нишка комплементарен на образецот на матичната нишка ДНК.

Стандардниот процес на PCR е поделен на три чекори:

1.Денатурација: Користете висока температура за да ги одделите двојните нишки на ДНК.Водородната врска помеѓу двојните нишки на ДНК е прекината на висока температура (93-98℃).

2.Anealing: Откако ќе се одвои двоверижната ДНК, намалете ја температурата за да може прајмерот да се врзе за едноверижната ДНК.

3. Екстензија: ДНК полимеразата започнува да синтетизира комплементарни нишки долж ДНК нишките од прајмерите врзани кога температурата е намалена.Кога продолжувањето е завршено, циклусот е завршен, а бројот на фрагменти на ДНК се удвојува

Повторувајќи ги овие три чекори 25-35 пати, бројот на фрагменти на ДНК експоненцијално ќе се зголеми.

Генијалноста на PCR е во тоа што различни прајмери ​​може да се дизајнираат за различни целни гени, така што целните генски фрагменти може да се засилат за краток временски период.

Досега, PCR може да се подели во три категории, имено обичен PCR, флуоресцентен квантитативен PCR и дигитален PCR.

Првата генерација на обичен PCR

Користете обичен инструмент за засилување на PCR за да го засилите целниот ген, а потоа користете електрофореза со гел агароза за да го откриете производот, може да се направи само квалитативна анализа.

Главните недостатоци на првата генерација на PCR:

1.Склони кон неспецифично засилување и лажно позитивни резултати.

2. Откривањето трае долго време и операцијата е гломазна.

3. Може да се направи само квалитативен тест

Втора генерација на PCR во реално време

PCR во реално време, исто така познат како qPCR, користи флуоресцентни сонди кои можат да укажат на напредокот на системот за реакција и ја следи акумулацијата на засилените производи преку акумулација на флуоресцентни сигнали и ги оценува резултатите преку кривата на флуоресценција.Може да се квантифицира со помош на вредноста на Cq и стандардната крива.

Бидејќи qPCR технологијата се изведува во затворен систем, веројатноста за контаминација е намалена, а флуоресцентниот сигнал може да се следи за квантитативно откривање, па затоа е најшироко користена во клиничката пракса и стана доминантна технологија во PCR.

Флуоресцентните супстанции што се користат во флуоресцентна квантитативна PCR во реално време може да се поделат на: TaqMan флуоресцентна сонда, молекуларни светилници и флуоресцентна боја.

1) TaqMan флуоресцентна сонда:

За време на PCR засилување, се додава специфична флуоресцентна сонда додека се додава пар прајмер.Сондата е олигонуклеотид и двата краја се означени со известувачка флуоресцентна група и флуоресцентна група за гаснење.

Кога сондата е недопрена, флуоресцентниот сигнал емитиран од групата известувач се апсорбира од групата за гаснење;за време на PCR засилување, активноста на 5'-3' егзонуклеаза на ензимот Taq ја расцепува и деградира сондата, со што известувачката флуоресцентна група и гаси. флуоресцентниот сигнал е целосно синхронизиран со формирањето на производот PCR.

2) SYBR флуоресцентна боја:

Во системот за реакција на PCR, се додава вишок на SYBR флуоресцентна боја.Откако флуоресцентната боја SYBR е неспецифично инкорпорирана во двојната жица на ДНК, таа емитува флуоресцентен сигнал.Молекулата на бојата SYBR што не е инкорпорирана во синџирот нема да емитува никаков флуоресцентен сигнал, со што ќе се осигури дека флуоресцентниот сигнал Зголемувањето на производите на PCR е целосно синхронизирано со зголемувањето на PCR производите.SYBR се врзува само за двоверижна ДНК, така што кривата на топење може да се користи за да се утврди дали реакцијата на PCR е специфична.

3) Молекуларен светилник:

Тоа е двојна означена олигонуклеотидна сонда со стебло-јамка која формира структура на фиба од околу 8 бази на 5-от и 3-от крај.Нуклеинските киселински секвенци на двата краја се комплементарно спарени, што предизвикува флуоресцентната група и групата за гаснење да бидат затегнати.Затвори, нема да се произведува флуоресценција.

Откако ќе се генерира производот на PCR, за време на процесот на жарење, средниот дел од молекуларниот светилник е спарен со специфична ДНК секвенца, а флуоресцентниот ген се одвојува од генот за гаснење за да произведе флуоресценција.

Главните недостатоци на PCR од втората генерација:

Сè уште недостасува чувствителност, а откривањето на примероци со ниска копирање е неточно.

Постои влијание на вредноста на позадината, а резултатот е подложен на пречки.

Кога има PCR инхибитори во системот за реакција, резултатите од детекцијата се подложни на пречки.

Трета генерација дигитален PCR

Дигитален PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) го пресметува бројот на копии на целната секвенца преку откривање на крајната точка и може да изврши точна апсолутна квантитативна детекција без користење на внатрешни контроли и стандардни криви.

Дигиталниот PCR користи откривање на крајната точка и не зависи од вредноста на Ct (праг на циклусот), така што на дигиталната PCR реакција помалку влијае ефикасноста на засилување, а толеранцијата кон инхибиторите на реакцијата на PCR е подобрена, со висока точност и репродуктивност.

Поради карактеристиките на висока чувствителност и висока точност, не е лесно да се мешаат со инхибитори на PCR реакција и може да се постигне вистинска апсолутна квантификација без стандардни производи, што стана жариште за истражување и примена.

Според различните форми на единицата за реакција, може да се подели на три главни типа: микрофлуидни, чипови и системи со капки.

1) Микрофлуидна дигитална PCR, mdPCR:

Врз основа на микрофлуидната технологија, шаблонот на ДНК е одделен.Микрофлуидната технологија може да го реализира примерокот нано-надградба или генерирање на помали капки, но на капките им треба посебен метод на адсорпција и потоа да се комбинираат со системот за реакција на PCR.mdPCR постепено се усвои со други методи замени.

2) Дигитален PCR базиран на капки, ddPCR:

Користете ја технологијата за создавање капки вода во масло за да го обработите примерокот во капки и поделете го реакциониот систем што содржи молекули на нуклеинска киселина на илјадници капки нано, од кои секоја не ја содржи целната молекула на нуклеинска киселина што треба да се открие или содржи една до неколку целни молекули на нуклеинска киселина што треба да се тестираат.

3) Дигитален PCR базиран на чип, cdPCR:

Користете ја технологијата за интегрирана патека на течност за да гравирате многу микроцевки и микрошуплини на силиконски наполитанки или кварцно стакло и контролирајте го протокот на растворот преку различни контролни вентили и поделете ја течноста од примерокот на нанометри со иста големина во реакционите бунари за дигитална PCR реакција за да постигнете апсолутна квантификација.

Главните недостатоци на третата генерација на PCR:

Опремата и реагенсите се скапи.

Барањата за квалитет на шаблоните се високи.Ако количината на шаблонот ја надмине количината на микросистем, ќе биде невозможно да се измери, а ако е премногу мала, точноста на квантификацијата ќе се намали.

Лажни позитиви може да се генерираат и кога има неспецифично засилување.