PCR, повеќекратни PCR, In situ PCR, Обратна PCR, RT-PCR, qPCR (1)-PCR

Ќе ги средиме концептите, чекорите и деталите за различните PCR

Ⅰ. PCR

Полимеразна верижна реакција, позната како PCR, е молекуларна биолошка технологија која се користи за зголемување на специфичните фрагменти на ДНК.Може да се смета како посебна репликација на ДНК ин витро.ДНК полимеразата (ДНК полимераза I) беше откриена уште во 1955 година, а Кленов фрагмент од Е. Коли, кој има експериментална вредност и практичност, беше откриен од д-р Х. Кленов во раните 1970-ти, но бидејќи овој ензим не поднесува температура, високата температура може да го дегенерира, па затоа не ја намалува реакцијата на високата температура на полимерацијата.Ензимите кои се користат денес (наречени Taq полимераза), беа изолирани од Thermus aquaticus, бактерија на топли извори во 1976 година. Нејзината карактеристика е што може да се спротивстави на високи температури и е идеален ензим, но широко се користи по 1980-тите.Оригиналниот концепт на оригиналниот примитивен прототип на PCR е сличен на поправка и копирање на гените, што беше предложено од д-р КЈел Клеп во 1971 година. Тој ја објави првата едноставна и краткорочна генска копија (слично на првите два циклусни реакции на PCR).ПЦР развиен денес беше развиен од д-р Кари Б. Мулис во 1983 година. Д-р Мулис им служеше на компаниите за ПЕ таа година, така што ПЕ има посебен статус во индустријата за ПЦР.Д-р Мулис официјално го објави првиот поврзан труд со Саики и други во 1985 година. Оттогаш, употребата на PCR е илјадници милји дневно, а квалитетот на сродните трудови може да се каже дека ги прави многу други методи на истражување непријатни.Последователно, PCR технологијата е широко користена во биолошкото научно истражување и клиничките апликации, станувајќи најважна технологија за истражување на молекуларната биологија.Мулис ја доби и Нобеловата награда за хемија во 1993 година.

PCRПринцип

Основниот принцип на PCR технологијата е сличен на процесот на природна репликација на ДНК, а неговата специфичност зависи од олигонуклеотидниот прајмер кој е комплементарен на двата краја на целната секвенца.ПЦР се состои од три основни чекори на реакција: дегенерација-заживување-проширување: ①Дегенерација на шаблонот ДНК: Откако шаблонот ДНК ќе се загрее на околу 93°C одреден временски период, двојниот ДНК раствор за ДНК со двоен синџир формиран со PCR засилување на шаблонот ДНК.②Грижење (соединение) на шаблонот ДНК и прајмерот: Откако шаблонот ДНК ќе се загрее и дегенерира во еден синџир, температурата паѓа на околу 55°C.Комплементарната низа на прајмерот и шаблонот ДНК со еден синџир.③Продолжување на прајмерот: шаблон за ДНК - врзувањето на прајмерот се заснова на дејството на TaqDNA полимеразата, со dNTP како реакциона суровина.Задржете го принципот на репликација, синтетизирајте нов полурезервиран синџир на копирање што го надополнува синџирот на ДНК на шаблонот и трите процеси со повторување на циклусот дегенерација-жаривање-продолжување може да добијат повеќе „полурезервиран синџир на копирање“ и овој нов синџир е повторно достапен Станете шаблон за следниот циклус.Потребни се 2-4 минути за да се заврши циклусот, целниот ген може да се засили неколку милиони пати за 2-3 часа.

СтандарденPCRСистем за реакција

Пет елементи на PCR реакција

Постојат главно пет видови на супстанции вклучени во PCR реакцијата, имено прајмер, ензим, dNTP, шаблон и пуфер (потребен е Mg2+).[ПЦР процедура]

Стандардниот процес на PCR е поделен на три чекори

1. Дегенерација на ДНК (90°C-96°C): Шаблони на ДНК со двоен синџир под термичко дејство, водородните врски се прекинуваат, формирајќи ДНК со еден синџир.

2. Греење (25℃ -65℃): Температурата на системот се намалува, прајмерот се комбинира со шаблонот ДНК за да се формира локален двоен синџир.

3. Екстензија (70℃ -75℃): Под дејство на ензимот Taq (околу 72°C, најдобра активност), dNTP се користи како суровина, се протега од 5' крајот на прајмерот → 3' крај, синтезата и шаблонот се надополнуваат еден со друг ДНК синџир.

Секој циклус е денатуриран, анелиран и продолжен, удвојувајќи ја содржината на ДНК.Во моментов, поради кратката област на засилување, дел од PCR може да се реплицираат за многу кратко време, дури и ако активноста на ензимот Taq не е оптимална, така што може да се промени во два чекори, односно, жарењето и продолжувањето може да се изведат на 60°C-65°C истовремено.Со цел да се намали процесот на кревање и ладење и да се подобри брзината на одговор.

Карактеристики на PCR реакција

● Висока специфичност

Специфичните одлучувачки фактори на PCR одговорот се: ① Специфичната комбинација на прајмерот и шаблонот ДНК.② Принципот на спарување на базите.③ Лојалноста на реакцијата на синтеза на TaqDNA полимераза.④ Специфичноста и конзервативноста на целниот ген.

Правилната комбинација на прајмери ​​и шаблони е клучот.Врзувањето на прајмерот и шаблонот и продолжувањето на ланецот на прајмер се засноваат на принципот на совпаѓање на алкалната основа.Лојалноста на реакциите на синтеза на полимераза и високата температурна отпорност на Taq DNA полимеразата за да се направи врзувањето (соединението) на шаблонот и прајмерот во реакцијата може да се изведат на повисока температура.Специфичноста на комбинацијата е значително зголемена.Клипот може да одржува висок степен на исправност.Со избирање на целен генетски регион со висока конзервативност и висока конзервативност, неговата специфичност е поголема.

● Висока чувствителност

Обемот на производство на PCR производи се зголемува со индекс, што може да го прошири почетниот шаблон на Picker (PG=10-12) за да го зголеми нивото на микроконтролерот до ниво на микрограми (μg= -6).Целните клетки може да се детектираат од 1 милион клетки;при откривање на вируси, чувствителноста на PCR може да достигне 3 RFU (празни точки формирани единици);минималната стапка на откривање во бактериската наука е 3 бактерии.

● Едноставно и брзо

Рефлексијата на PCR користи високотемпературна Taq ДНК полимераза, која го додава реакцискиот раствор во исто време, односно реакција на дегенерација-аннеална екстензија на растворот за засилување на ДНК и садот за водена бања.Општо земено, реакцијата на засилување завршува за 2 до 4 часа.Зголемените производи генерално се анализираат со електричен меч и не мора да користат изотопи, без радиоактивно загадување и лесна промоција.

● Чистотата на примерокот е мала

Нема потреба да се одвојуваат вируси или бактерии и клетки од култура.ДНК суровите производи и РНК може да се користат како засилувачи.Откривањето на засилување на ДНК може да се користи директно со користење на клинички примероци како што се крв, телесни течности, течност за миење кашлица, коса, клетки и живо ткиво.

PCRзаеднички проблеми

● Лажно негативно, без засилени опсези

Клучните фази на PCR реакцијата вклучуваат: ① подготовка на шаблонски нуклеински киселини, ② квалитет и специфичност на прајмерите, ③ квалитетот на ензимите ④ услови на циклус на PCR.Наоѓањето на причината исто така треба да се анализира и проучи за горенаведените врски.

Шаблони: ① Шаблонот содржи различен протеин, ② Шаблонот содржи инхибитор на Taq ензим, ③ Протеинот во шаблонот не е елиминиран, особено групниот протеин во хромозомот.⑤ Дегенерацијата на нуклеинската киселина на деминерот не е темелна.Кога квалитетот на ензимите и прајмерите е добар, нема лента за засилување, што е најверојатно дигестивниот третман на примероците.Нешто не е во ред со процесот на екстракција на шаблонот на нуклеинска киселина, така што за да се подготви ефикасен и стабилен раствор за варење, неговата процедура треба да се поправи, а не произволно да се менува.

Ензимска инактивација: нов ензим или стари и нови ензими треба да се користат заедно за да се анализира дали ензимската активност е изгубена или недоволна, што доведува до лажни негативни.Треба да се забележи дека ензимот Taq или етидиум бромид понекогаш се забораваат.

Прајмер: квалитетот на прајмерот, концентрацијата на прајмерот и дали концентрацијата на двата прајмери ​​е симетрична.Тоа е честа причина за неуспехот на PCR или зголемениот опсег не е идеален и склон кон дифузија.Има проблеми со квалитетот на прајмерите на некои сериски броеви.Двата прајмери ​​имаат висока концентрација и ниска концентрација, што предизвикува асиметрично засилување со ниска ефикасност.Контрамерките се: ① Изберете добар прајмер за синтеза на единици.② Концентрацијата на прајмерот не зависи само од вредноста на OD, туку и обрнува внимание на оригиналната течност на прајмерот за да се направи електрофореза со гел со агар шеќер.Мора да има зона на лента за прајмер, а осветленоста на двата прајмери ​​треба да биде генерално конзистентна.Појасот, PCR може да не успее во овој момент и треба да се реши со единицата за синтеза на прајмер.Ако прајмерот е висок, осветленоста е мала, а неговата концентрација мора да биде избалансирана кога се разредува.③ Прајмерот треба да се плати и да се чува во висока концентрација за да се спречи повеќекратно замрзнување или долгорочно ладење на делови од фрижидерот, што ќе предизвика распаѓање и деградирање на прајмерот.④ Дизајнот на прајмерот е неразумен, како на пример, должината на прајмерот е недоволна, а ди-кластерот е формиран помеѓу прајмерите.

Концентрација на Mg2+: Концентрацијата на Mg2+јон има големо влијание врз ефикасноста на засилување на PCR.Прекумерната концентрација може да го намали спротивниот пол на PCR засилување.Ако концентрацијата е премногу ниска, излезот на засилување на PCR дури и ќе предизвика неуспех на PCR засилувањето без експанзиониот опсег.

Промена на волуменот на реакцијата: Волуменот што се користи при PCR засилување е 20ul, 30ul и 50ul или 100uL, големиот волумен на апликацијата за PCR засилување е поставен според различни цели на научно истражување и клиничко тестирање.По правењето мали волумени како 20ул, потребно е да се направи состојба на кабелот при изработката на големината, во спротивно ќе пропадне.

Физички причини: Трансформацијата е многу важна за PCR засилување.Ако температурата на дегенерација е ниска, времето на дегенерација е кратко, тоа е веројатно да се случи во лажни негативни;премногу ниската температура на жарење може да предизвика неспецифично засилување и да ја намали специфичната ефикасност на засилување.Многу влијае на комбинацијата на прајмери ​​и шаблони за да се намали ефикасноста на засилување на PCR.Понекогаш е неопходно да се користат стандардни термометри за да се открие варијабилноста, жарењето и продолжената температура во продолжетокот или шпоретот растворлив во вода, што е една од причините за неуспехот на PCR.

Варијанти на целната секвенца: Ако се случи целната секвенца, мутација или бришење, комбинацијата на прототипот и шаблонот се комбинира или поради недостаток на целна секвенца, прајмерот и шаблонот ќе ја изгубат комплементарната низа, а неговото засилување со PCR нема да биде успешно.

● Лажно позитивно

Опсегот за засилување на PCR изгледа конзистентен со опсегот на целната секвенца, а понекогаш и неговиот опсег е поуреден и повисок.

Дизајнот на прајмерот не е соодветен: избраната секвенца за засилување и секвенцата на ненаменска засилување имаат хомологни, така што кога се засилува PCR, засилените производи на PCR се ненаменски секвенци.Целната низа е премногу кратка или прајмерот е премногу краток и е склон кон лажно позитивни.Треба да се редизајнира.

Вкрстено загадување на целната секвенца или производи за засилување: Постојат две причини за ова загадување: Прво, вкрстено загадување на целиот геном или големи сегменти, што доведува до лажни позитиви.Овој вид на лажно позитивно може да се реши со следниве методи: Бидете внимателни и нежни за време на работата за да спречите целната секвенца да се вдиши во пиштолот за примерок или да испрска надвор од центрифугалната цевка.Освен за ензими и супстанции кои не можат да издржат високи температури, сите реагенси или опрема треба да се дезинфицираат со висок притисок.Центрифугалните цевки и примероците треба да се користат истовремено.Кога е потребно, пред да се додадат примероците, реакционата цевка и реагенсот се изложени на ултравиолетови зраци за да се уништи постоечката нуклеинска киселина.Второ, мали фрагменти во загадувањето на воздухот.Овие мали фрагменти се пократки од целната низа, но имаат одредена хомологија.Може да се спои еден со друг.По дополнувањето на прајмерите, PCR производот може да се прошири, што ќе предизвика лажно позитивно производство.Може да се користи за да се намали или елиминира методот на гнездо PCR.

● Се појавува неспецифични појас на засилување

Појасите што се појавија по PCR засилувањето се неконзистентни со очекуваната големина, или се големи или мали, или во исто време, или во исто време, специфичните опсези на засилување и неспецифичните опсези на засилување.Појавата на неспецифични ленти е: Прво, прајмерите се нецелосни комплементарни со целната секвенца или полимеризацијата на прајмерот за да се формира ди кластер.Втората е дека концентрацијата на MG2+ јоните е превисока, температурата на жарење е премногу ниска, а бројот на циклуси на PCR е поврзан.Второ, квалитетот и количината на ензими.Често, ензимите од некои извори се склони кон неспецијални ленти, а ензимите од другиот извор не се појавуваат.Понекогаш се случува и неспецифично засилување на ензимите.Контрамерките се: редизајнирање на атрактивности доколку е потребно.Намалете ја количината на ензимот или заменете го ензимот од друг извор.Намалете ја количината на примарна, соодветно зголемете ја количината на шаблони и намалете го бројот на циклуси.Правилно зголемете ја температурата на жарење или користете го методот со две температурни точки (дегенерација од 93°C, жарење и продолжување на околу 65°C).

● Се појави ронлив влечење или размачкана лента

Понекогаш се чини дека засилувањето со PCR се применува или гранатира или појас налик на тепих.Од причина, поради прекумерната количина на ензими или лошиот квалитет на ензимот, концентрацијата на dNTP е превисока, концентрацијата на Mg2+ е превисока, температурата на жарење е премногу ниска, а бројот на циклуси е премногу.Контрамерките се: ① Намалување на количината на ензими или промена на ензимот од друг извор.②Намалете ја концентрацијата на dNTP ③ Правилно намалете ја концентрацијата на Mg2+.④Зголемете ја количината на шаблони и намалете го бројот на циклуси.

Поврзани производи

PCR Heroᴹ (со боја)

◮ Повисока верност: 6 пати поголема од обичниот ензим Taq;

◮ Побрза брзина на засилување

◮ Повеќе приспособливост на шаблоните

◮ Поголема ефикасност на засилување

◮ Еколошката толеранција е посилна: поставена на 37°C една недела, одржувајќи повеќе од 90% активност;

◮ Има 5'→3' ДНК полимеразна активност и 5'→3' егзонуклеазна активност, без 3'→5' егзонуклеазна активност.

PCR Easyᵀᴹ (со боја)

Уникатниот систем за реакција и високата ефикасност Taq DNA полимераза прават реакцијата на PCR да има поголема ефикасност на засилување, специфичност и чувствителност.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Еден чекор)-SYBR Green I

◮ Комплетот во еден чекор прави обратна транскрипција и qPCR две реакции во иста цевка, само треба да се додаде шаблон РНК, специфични PCR прајмери ​​и ddH без RNase₂O.

◮ Комплетот може брзо и ефикасно квантитативно да анализира вирусна РНК или РНК во трага.

◮ Комплетот користи уникатен Foregene реагенс за обратна транскрипција и Foregene HotStar Taq DNA полимераза во комбинација со уникатен систем за реакција за ефикасно подобрување на ефикасноста на засилување и специфичноста на реакцијата.

◮ Оптимизираниот систем за реакција прави реакцијата да има поголема чувствителност на откривање, посилна термичка стабилност и подобра толеранција.

◮ RT-qPCR Лесно^TM(Еден чекор) - Комплетот SYBR Green I доаѓа со внатрешна референтна боја ROX, која може да се користи за елиминирање на заднината на сигналот и грешките во сигналот помеѓу бунарите, што е погодно за клиентите да го користат во различни модели на квантитативни PCR инструменти.

RT Лесно^TMII (Мастер премикс за синтеза на cDNA на првата нишка заПЦР во реално време)

-Ефикасна способност за отстранување на gDNA, што може да ја отстрани gDNA во шаблонот во рок од 2 минути.

-Ефикасен систем за обратна транскрипција, потребни се само 15 минути за да се заврши синтезата на првата нишка cDNA.

-Сложени шаблони: шаблоните со висока содржина на GC и сложена секундарна структура, исто така, може да се менуваат со висока ефикасност.

-Систем за обратна транскрипција со висока чувствителност, шаблоните на ниво на pg може да добијат и висококвалитетна cDNA.

- Системот за обратна транскрипција има висока термичка стабилност, оптималната температура на реакцијата е 42℃, а сепак има добри перформанси на обратна транскрипција на 50℃.