RT-qPCR е основниот експеримент на молекуларната биологија и секој мора да биде запознаен со него.Тоа главно вклучува три чекори: екстракција на РНК, обратна транскрипција во cDNA и флуоресцентна квантитативна PCR во реално време.Не помага, што се случува?Многу е веројатно дека има проблем соекспериментот со обратна транскрипција!Иако се чини дека експериментот за обратна транскрипција треба само да додаде РНК, dNTP, прајмери ​​иреверзна транскриптазадо цевката за центрифуга и добро измешајте, но во реалниот процес на работа, сè уште има многу детали на кои треба да се обрне внимание.Ајде да научиме за тоа!

Како да се процени квалитетот на РНК?
За да се добие cDNA, квалитетот на РНК е критичен!Квалитетот на РНК може да се открие главно од два аспекта:
(1) Интегритет на РНК:Интегритетот на РНК може да се потврди со електрофореза со гел агароза. Земајќи ги еукариотите како пример, целосната вкупна РНК има три јасни појаси, молекуларните тежини од големи до мали се 28S, 18S и 5S, а 28S е двојно посветла од 18S;ако може да се видат три ленти, но типот на лентата е заматен или Дифузијата значи дека РНК е делумно деградирана.Во овој момент, веднаш изведете ја реакцијата на обратна транскрипција и соодветно зголемете го внесувањето на шаблонот;ако може да се види само лента со мала молекуларна тежина или без лента, РНК е целосно деградирана и треба повторно да се екстрахира.Agilent 2100 го покажува интегритетот на РНК со пик дијаграм и RIN вредност.Ако нуклеинската киселина е недопрена, основната линија на електроферограмот е рамна;ако нуклеинската киселина е сериозно деградирана, основната линија е нерамна и се појавуваат повеќе врвови на деградација;вредноста на RIN го одразува интегритетот на РНК, во опсег од 0-10, колку е поголема вредноста, толку е подобар квалитетот на РНК.Па, колку е поголем степенот на комплетноста.
(2) Чистота на РНК:Односот на OD260/280 може да се открие со УВ спектрофотометрија.Ако односот на OD260/280 е помеѓу 1,9 и 2,1, чистотата е многу добра.
Преостанатата геномска ДНК може да доведе до неточни квантитативни резултати
Кога се екстрахира РНК, РНК што ја добиваме може да се меша со геномска ДНК (gDNA) што не е исчистена.Затоа, cDNA по обратна транскрипција, исто така, ќе се меша соgDNA.Во текот на низводнотоqPCRреакција,cDNAи gDNA може да се засилуваат истовремено, што резултира со релативно мала вредност на КТ, па резултатите може да бидат пристрасни.
Значи, што треба да правиме во оваа ситуација?Foregeneпредлага:
(1) Изведете чистење на геномот на обратната РНК, која може да се отстрани со екстракција на колона за време на екстракцијата на РНК;
(2) Третирајте ја извлечената РНК со DNaseI , но прекинете го со EDTA;
на реагенси за обратна транскрипцијасо модули за чистење на геномот;

Како да изберете прајмери ​​за обратна транскрипција?
Прајмерите за обратна транскрипција, исто така, влијаат на исходот од реакцијата на обратна транскрипција.Можете да изберете случајни прајмери, Oligo dT или генски специфични прајмери ​​за обратна транскрипција според специфичните околности на експериментот:
(1) Специфични записници: се препорачуваат ген-специфични прајмери;
(2) Преписи на долги фрагменти: Се препорачуваат олиго dT/генски специфични прајмери;
(3) Внатрешни фрагменти од преписи со долги сегменти: ген-специфични прајмери/ случајни прајмери ​​/случајни прајмери ​​+ Олиго dT.Ако се изврши последователниот qPCR експеримент, Oligo dT не може да се користи сам, бидејќи само користењето на Oligo dT може да предизвика пристрасност на 3' крајот, што ќе доведе до неточни резултати од qPCR експериментот;
(4) miRNA: Може да се користат прајмери ​​со матични јамки или прајмери ​​за јалови.

Колку пати треба да се разреди cDNA на производот од обратна транскрипција за да се измери?
По добивањето на cDNA на производот за обратна транскрипција, многу е важно колку пати cDNA треба да се разреди за qPCR експерименти.Ако концентрацијата на cDNA е премногу висока или премногу ниска, ефикасноста на засилување може да биде засегната.Дали може да се измери концентрацијата на cDNA и како треба да се направи тоа?
(1) Концентрацијата на cDNA на производот за реверзна транскрипција не може да се измери, бидејќи покрај производот за реверзна транскрипција, производот за обратна транскрипција содржи и резидуален пуфер од реверзна транскрипција, реверзна транскриптаза, прајмери ​​итн., што ќе се меша со резултатите од мерењето на концентрацијата и ќе предизвика OD260/280, аб200, не е точно и OD200D.Во ова време, некои пријатели ќе речат, тогаш ќе ја измерам концентрацијата по прочистувањето;Овде, Foregene сака да потсети дека cDNA не се препорачува да се прочистува, бидејќи должината на cDNA добиена со пресврт е различна, а кратката cDNA ќе се изгуби при прочистувањето.
(2) Па што да правам?Пред експериментот qPCR, градиентот на разредување на cDNA може да се одреди преку предекспериментот.На пример: користете залихи на cDNA раствор, 10-кратно разредување и 100-кратно разредување како шаблони за експерименти qPCR и изберете го факторот на разредување со вредност на КТ во опсег од 18-28.

Како треба да се транскрибираат miRNAs обратно?
МиРНК е едноверижна мала молекула РНК со големина од околу 22 nt која не кодира протеин.Поради неговата кратка должина, конвенционалниот qPCR метод е тешко директно да се квантифицира, па често е неопходно да се прошири miRNA;најчесто користените методи на обратна транскрипција за miRNA вклучуваат метод на стебло-јамка и метод на опашка.
Методот на стебло-јамка е да се прошири miRNA со додавање на прајмери ​​со матични јамки.Овој метод на откривање има поголема чувствителност и специфичност, но пропусната моќ на откривање е мала.Една обратна транскрипција може да открие само една miRNA и внатрешна референца;методот на додавање на опашката е составен од два Се комплетира со заедничко дејство на два ензими, кои се PolyA полимераза и реверзна транскриптаза.PolyA полимеразата е одговорна за додавање на PolyA опашки на miRNA за да се зголеми нејзината должина, а обратната транскриптаза врши реакција на обратна транскрипција.Овој метод има висока пропусност за откривање и може да открие повеќе miRNA и внатрешни референци во една обратна транскрипција, но чувствителноста и специфичноста се ниски во методот на стебло-јамка.