Неколку револуционерни пронајдоци во историјата на технологијата за откривање во мојот ум се технологија за имуноозначување заснована на принципот на специфично врзување на антиген-антитело, технологија на PCR и технологија на секвенционирање.Денес ќе зборуваме за PCR технологијата.Според еволуцијата на PCR технологијата, луѓето вообичаено ја делат PCR технологијата на три генерации: обична PCR технологија, флуоресцентна квантитативна PCR технологија во реално време и дигитална PCR технологија.
Cвообичаена PCR техника
КАРИ МУЛИС (1944.12.28-2019.8.7)
Кари Малис ја измислил верижната реакција на полимераза (полимеразна верижна реакција, PCR) во 1983 година. Се вели дека кога ја возел својата девојка, одеднаш добил блесок на инспирација и помислил на принципот на PCR (за придобивките од возењето).Кари Малис ја доби Нобеловата награда за хемија во 1993 година. Њујорк Тајмс коментира: „Многу оригинално и значајно, речиси ја дели биологијата на пред-ПЦР и пост-ПЦР ери.
Принципот на ПЦР: Под катализа на ДНК полимераза, ДНК на матичната нишка се користи како шаблон, а специфичниот прајмер се користи како почетна точка на продолжување, а ДНК-та на ќерката нишка комплементарна на шаблонот на матичната низа ДНК се копира in vitro преку денатурација, жарење, екстензија и други чекори.Тоа е технологија за засилување за синтеза на ДНК ин витро, која може брзо и конкретно да ја засили секоја целна ДНК ин витро.
Предности на обичните PCR
1.Класичен метод, комплетни меѓународни и домашни стандарди
2.Пониска цена на реагенси за инструменти
3.Производите на PCR може да се обноват за други експерименти со молекуларна биологија
Препорачана машина Foregene PCR: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Поврзани производи: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Недостатоци на обичните PCR
1.лесно се загадува
2.гломазна операција
3.само квалитативна анализа
4.Умерена чувствителност
5.Има неспецифично засилување и кога неспецифичната лента е со иста големина како целната лента, не може да се разликува
CПЦР базиран на апиларна електрофореза
Како одговор на недостатоците на обичните PCR, некои производители воведоа инструменти засновани на принципот на капиларна електрофореза.Чекорот на електрофореза по PCR засилување е завршен во капиларот.Чувствителноста е поголема, а разликата од неколку бази може да се разликува и засилувањето да се пресмета со MAERKER.содржината на производот.Недостаток е што производот PCR сè уште треба да се отвори и да се стави во инструментот, а сè уште постои голем ризик од контаминација.
CаппиларенEелектрофореза
2. Технологија на флуоресцентна квантитативна PCR (квантитативна во реално време PCR, qPCR) во реално времеФлуоресцентна квантитативна PCR, исто така наречена во реално време PCR, е нова квантитативна технологија на нуклеинска киселина развиена од PE (Перкин Елмер) во 1995 година. Историјата на развојот на флуоресцентната квантитативна PCR е историја на возбудливи борби на гигантите како што се ABI, Roche и Bio-Rad.Ако сте заинтересирани, можете да го проверите.Оваа техника во моментов е најзрелата и најшироко користена полуквантитативна PCR техника.
Препорачана qPCR машина:https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
Метод на флуоресцентна боја (SYBR Green I):SYBR Green I е најчесто користената боја за врзување на ДНК за квантитативна PCR, која неспецифично се врзува за двоверижна ДНК.Во слободна состојба, SYBR Green емитира слаба флуоресценција, но откако ќе се врзе за двоверижна ДНК, неговата флуоресценција се зголемува 1000 пати.Затоа, вкупниот флуоресцентен сигнал емитиран од реакцијата е пропорционален на количината на присутна двоверижна ДНК и ќе се зголемува со зголемувањето на засилениот производ.Бидејќи бојата неспецифично се врзува за двоверижна ДНК, може да се генерираат лажно позитивни резултати.
Поврзани производи: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
Метод на флуоресцентна сонда (Такман технологија): За време наPCR засилување, специфична флуоресцентна сонда се додава истовремено со пар прајмери.Сондата е линеарен олигонуклеотид, со флуоресцентна известувачка група и флуоресцентна група за гаснење соодветно означени на двата краја.Кога сондата е недопрена, флуоресцентниот сигнал емитиран од групата известувач се апсорбира од групата за гаснење, а откривањето Нема флуоресцентен сигнал;за време на PCR засилување (во фазата на екстензија), активноста на 5'-3' Dicer на ензимот Taq ќе ја свари и деградира сондата, така што флуоресцентната група известувач и флуоресцентната група за гаснење се одвоени, така што системот за следење на флуоресценцијата може да се прими флуоресцентниот сигнал, односно секој пат кога се добива целосна молк. синхронизација на акумулација на флуоресцентни сигнали и формирање на PCR производи.Методот на сонда Такман е најчесто користен метод за откривање во клиничката детекција.
Поврзани производи: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
Предности на qPCR
1.Методот е зрел и опремата за поддршка и реагенсите се комплетирани
2.Средна цена на реагенсите
3.лесен за користење
4.Висока чувствителност и специфичност за откривање
Недостатоци на qPCR
Мутацијата на целниот ген води до промашено откривање.
Резултатот од откривањето на шаблонот со ниска концентрација не може да се одреди.
Има голема грешка при користење на стандардната крива за квантитативно откривање.
3. Дигитална PCR (дигитална PCR, dPCR) технологија
Дигиталната PCR е техника за апсолутна квантификација на молекулите на нуклеинската киселина.Во споредба со qPCR, дигиталната PCR може директно да го прочита бројот на молекули на ДНК/РНК, што е апсолутна квантификација на молекулите на нуклеинската киселина во почетниот примерок.Во 1999 година, Берт Вогелштајн и Кенет В. Кин-злер формално го предложија концептот на dPCR.
Во 2006 година, Fluidigm беше првиот што произведе комерцијален dPCR инструмент базиран на чип.Во 2009 година, Life Technologies ги лансираше системите OpenArray и QuantStudio 12K Flex dPCR.Во 2013 година, Life Technologies го лансираше системот QuantStudio 3DdPCR, кој користи технологија на микрофлуидни чипови со нано размери со висока густина за рамномерно распределување на примероците до 20.000 поединечни ќелии.во реакцијата добро.
Во 2011 година, Bio-Rad го лансираше инструментот заснован на капки QX100 dPCR, кој користи технологија вода во масло за рамномерно да го дистрибуира примерокот до 20.000 капки вода во масло и користи анализатор на капки за да ги анализира капките.Во 2012 година, RainDance го лансираше RainDrop dPCR инструментот, управуван од гас под висок притисок, за да се подели секој стандарден систем за реакција во реакциона емулзија која содржи од 1 милион до 10 милиони микро-капки на ниво на пиколитри.
Досега, дигиталниот PCR формираше две главни фракции, тип на чип и тип капки.Без разлика каков вид на дигитална PCR, неговите основни принципи се ограничување на разредување, крајна точка PCR и Poisson дистрибуција.Стандардниот систем за реакција на PCR што содржи шаблони на нуклеинска киселина е рамномерно поделен на десетици илјади PCR реакции, кои се дистрибуираат на чипови или микрокапки, така што секоја реакција содржи колку што е можно повеќе шаблон молекула, а се изведува PCR реакција со шаблон со една молекула.Со читање на флуоресценцијата Се брои присуството или отсуството на сигналот, а апсолутната квантификација се врши по калибрација на статистичката Поасонова распределба.
Следниве се карактеристиките на неколку дигитални PCR платформи што ги користев:
1. Bio-Rad QX200 капки дигитален PCR Bio-RadQX200 е многу класична дигитална PCR платформа, основниот процес на детекција: 20.000 примероци се генерираат од генератор на капки Микро-капките вода во масло се засилуваат на обична PCR машина и на крајот флуоресцентниот сигнал на секоја микро-капка се чита од читач на микро-капки.Операцијата е посложена, а ризикот од загадување е среден.
Xinyi TD1 микро-капки дигитален PCRXinyi TD1 е домашна дигитална PCR платформа, основниот процес на откривање: генерира 30.000-50.000 капки вода во масло преку генератор на капки, засилување на заеднички PCR инструмент и на крајот помине Читачот на капки го чита флуоресцентниот сигнал на секоја капка.И генерирањето капки и читањето во оваа платформа се изведуваат во наменски чип со низок ризик од контаминација.
STILLA Naica микро-капки чип дигитален PCRSTILLA Naica е релативно нова дигитална PCR платформа.Основниот процес на детекција е: додадете го реакцискиот раствор на чипот, ставете го чипот во системот за генерирање и засилување на микро-капки и генерирајте 30.000 микро-капки.Се шири на чипот и PCR засилувањето е завршено на чипот.Потоа засилениот чип се пренесува во системот за анализа на читање на микро капки, а флуоресцентниот сигнал се чита со фотографирање.Бидејќи целиот процес се одвива во затворен чип, ризикот од контаминација е мал.
4. ThermoFisher QuantStudio 3D чип дигитален PCR
ThermoFisher QuantStudio 3D е уште една класична дигитална PCR платформа базирана на чип.Нејзиниот основен процес на откривање е: додадете го реакциониот раствор во распрскувачот и растворот за реакција рамномерно распоредете го на чипот со 20.000 микробунари низ распрскувачот., ставете го чипот на PCR машината за да се засили, и на крајот ставете го чипот во читачот и фотографирајте за да го прочитате флуоресцентниот сигнал.Операцијата е релативно комплицирана, а целиот процес се изведува во затворен чип, а ризикот од контаминација е мал.
5. JN MEDSYS Clarity чип дигитален PCR
JN MEDSYS Clarity е релативно нова дигитална PCR платформа од типот на чип.Нејзиниот основен процес на детекција е: додадете го реакциониот раствор во апликаторот и рамномерно распоредете го растворот за реакција на 10.000 PCR цевки фиксирани во PCR цевката преку апликаторот.На микропорозниот чип, реакциониот раствор влегува во чипот преку капиларно дејство, а ПЦР цевката со чипот се става на PCR машината за засилување, а на крајот чипот се става во читачот за да го прочита флуоресцентниот сигнал со фотографирање.Операцијата е посложена.Ризикот од контаминација е низок.
Параметрите на секоја дигитална PCR платформа се сумирани на следниов начин:
Индикаторите за евалуација на дигиталната PCR платформа се: бројот на поделени единици, бројот на флуоресцентни канали, сложеноста на работата и ризикот од контаминација.Но, најважната работа е точноста на откривање.Еден начин да се проценат дигиталните PCR платформи е да се користат повеќе дигитални PCR платформи за да се верификуваат една со друга, а друг начин е да се користат стандардни супстанции со точни вредности.
Предности на dPCR
1.Постигнување апсолутна квантификација
2.Поголема чувствителност и специфичност
3.Може да открие примероци со ниски копии
Недостатоци на dPCR1. Скапа опрема и реагенси 2. Комплицирана работа и долго време на откривање 3. Тесен опсег на откривање
Во моментов, трите генерации на PCR технологијата имаат свои предности и недостатоци, и секоја има свои полиња за примена и не е врска дека едната генерација ја заменува другата.Постојаниот напредок на технологијата внесе нова виталност во PCR технологијата, овозможувајќи ѝ да отклучува една насока по друга на апликацијата, правејќи го откривањето на нуклеинската киселина поудобно и попрецизно.
Извор: Д-р Јуан ве води на тестирање
Препорачани производи:
Време на објавување: 18-11-2022 година
