PCR е најкористената технологија за засилување на нуклеинската киселина и е широко користена поради нејзината чувствителност и специфичност.Сепак, PCR бара повторена термичка денатурација и не може да се ослободи од ограничувањата за потпирање на инструменти и опрема, што ја ограничува неговата примена во клиничкото тестирање на теренот.

Од почетокот на 1990-тите, многу лаборатории почнаа да развиваат технологија за засилување на постојана температура која не бара термичка денатурација.Сега тие развија технологија за изотермално засилување со посредство на јамка, технологија за изотермално засилување за замена на жици, технологија за изотермално засилување во тркалачки круг и зависност од секвенца на нуклеинска киселина.Технологија на изотермално засилување и други технологии. 

Lизотермално засилување со посредство на oop

Принципот на засилување се заснова на фактот дека ДНК е во состојба на динамичка рамнотежа на околу 65°C.Кога било кој прајмер е спарен со бази и проширен на комплементарниот дел на двоверижна ДНК, другата нишка ќе се дисоцира и ќе стане едноверижна.

На оваа температура, ДНК користи 4 специфични прајмери ​​за да се потпре на ДНК полимераза со поместување на низата за да направи синтезата на ДНК со поместување на низата постојано да се самоциркулира.

Прво определете ги 6-те специфични региони F3, F2, F1, B1, B2, B3 на целниот ген, а потоа дизајнирајте 4 прајмери ​​врз основа на овие 6 специфични региони (како што е прикажано на сликата подолу):

Напредниот внатрешен прајмер (FIP) е составен од F1c и F2.

Назадниот внатрешен прајмер (BIP) е составен од B1c и B2, а TTTT се користи како разделник во средината.

Надворешните прајмери ​​F3 и B3 се соодветно составени од F3 и B3 региони на целниот ген.

Во системот за реакција LAMP, концентрацијата на внатрешниот прајмер е неколку пати поголема од онаа на надворешниот прајмер.Внатрешниот прајмер најпрво се комбинира со шаблонот за да се синтетизира комплементарна нишка за да се формира ДНК двојна нишка.Последователно, надворешниот прајмер се комбинира со шаблонот за да се формира двојна нишка на ДНК.Под дејство на BstDNA полимеразата, комплементарната нишка синтетизирана од внатрешниот прајмер се ослободува.По серија реакции, комплементарната нишка конечно формира единечна ДНК влакно со структура на гира.

Структурата на гира сама поединечно ДНК се користи како шаблон за континуирано формирање на преодна структура на ДНК на стебло-јамка со отворен крај.Внатрешниот и надворешниот прајмери ​​ја водат ДНК структурата на преодната стебло-јамка континуирано да претрпува реакции на поместување и проширување на жицата и на крајот да формираат повеќе структури на стебло-јамки со различни должини.ДНК смеса.

Предности и недостатоци на изотермалното засилување со посредство на јамка

Предности на ЛАМП:

(1) Висока ефикасност на засилување, која може ефикасно да засили 1-10 копии од целниот ген во рок од 1 час, а ефикасноста на засилување е 10-100 пати поголема од онаа на обичната PCR.

(2) Времето на реакција е кратко, специфичноста е силна и не е потребна посебна опрема.

Недостатоци на LAMP:

(1) Барањата за прајмери ​​се особено високи.

(2) Засилениот производ не може да се користи за клонирање и секвенционирање, туку може да се користи само за проценка.

(3) Поради неговата силна чувствителност, лесно е да се формираат аеросоли, што предизвикува лажни позитиви и влијае на резултатите од тестот.

Sзасилување на транд поместување

Засилување со поместување на влакното (SDA) е техника на ин витро изотермална амплификација на ДНК заснована на ензимска реакција првпат предложена од американскиот научник Вокер во 1992 година.

Основниот систем на СДА вклучува рестриктивна ендонуклеаза, ДНК полимераза со активност на поместување на низата, два пара прајмери, dNTP и јони на калциум и магнезиум и пуферски системи.

Принципот на засилување со поместување на низата се заснова на хемиски модифицираната низа за препознавање на рестриктивната ендонуклеаза на двата краја на целната ДНК.Ендонуклеазата го отвора јазот во жицата ДНК на местото на нејзиното препознавање, а ДНК полимеразата го проширува јазот 3' Крај и ја заменува следната ДНК-низа.

Заменетите единечни нишки на ДНК може да се комбинираат со прајмери ​​и да се прошират во двојни нишки со ДНК полимераза.Овој процес се повторува постојано, така што целната секвенца е ефикасно засилена.

Предности и недостатоци на технологијата за засилување со поместување на жиците

Предности на SDA:

Ефикасноста на засилување е висока, времето на реакција е кратко, специфичноста е силна и не е потребна посебна опрема.

Недостатоци на СДА:

Производите не се униформни, а некои едножилни и двоверижни производи секогаш се произведуваат во циклусот SDA, а опашката неизбежно ќе се појави кога ќе се открие со електрофореза.

Rзасилување на кружниот круг

Засилување на тркалачки круг (RCA) се предлага со цртање на методот на копирање на ДНК од патогени организми со тркалачки круг.Тоа се однесува на употребата на едноверижна кружна ДНК како шаблон на константна температура и специјална ДНК полимераза (како што е Phi29) ) Под дејство на синтеза на ДНК во тркалачки круг за да се постигне засилување на целниот ген.

RCA може да се подели на линеарно засилување и експоненцијално засилување.Ефикасноста на линеарната RCA може да достигне 10⁵пати, а ефикасноста на експоненцијалната RCA може да достигне 10⁹времиња.

Едноставна разлика, како што е прикажано на сликата подолу, линеарното засилување a користи само 1 прајмер, експоненцијалното засилување b има 2 прајмери.

Линеарната RCA се нарекува и RCA со еден прајмер.Прајмер се врзува за кружна ДНК и се проширува со дејство на ДНК полимераза.Производот е линеарна единечна жичка со голем број повторувачки секвенци илјадници пати поголема од должината на една јамка.

Бидејќи производот на линеарната RCA е секогаш поврзан со стартниот прајмер, лесното фиксирање на сигналот е голема предност.

Експоненцијална RCA, позната и како Хипер разгрането засилување HRCA (Хипер разгрането RCA), во експоненцијалната RCA, еден прајмер го засилува RCA производот, вториот прајмер се хибридизира со производот RCA и се протега, а замената е веќе врзана за RCA производот.

Предностите и недостатоците на засилување на нуклеинската киселина со тркалачки круг

Предности на RCA:

Висока чувствителност, добра специфичност и лесно ракување.

Недостатоци на RCA:

Проблеми во позадина при откривање сигнал.За време на RCA реакцијата, нециркулираната сонда за катанец и шаблонот ДНК или РНК на неврзаната сонда може да генерираат некои позадински сигнали. 

Nзасилување засновано на низа на уклеикациди

Засилување базирано на секвенца на нуклеинска киселина (NASBA) е нова технологија развиена врз основа на PCR.Тоа е континуирано и изотермално засилување на нуклеинската киселина водено од пар прајмери ​​со промоторна секвенца Т7.Технологијата може да ја засили шаблонот РНК за околу 109 пати за околу 2 часа, што е 1000 пати повисоко од конвенционалниот метод на PCR и не бара посебна опрема.

Оваа технологија се користи за брзо дијагностицирање на болести веднаш штом се појави, а многу компании моментално го користат овој метод во комплетите за детекција на РНК.

Иако засилувањето на РНК може да користи и технологија за PCR со обратна транскрипција, NASBA има свои предности: може да се изврши под релативно константни температурни услови и е постабилна и попрецизна од традиционалната PCR технологија.

Реакцијата е на 41 Целзиусов степен и бара AMV (вирус на птичји миелобластоза) реверзна транскриптаза, RNase H, T7 RNA полимераза и пар прајмери ​​за да се комплетира.

Процесот главно вклучува:

Напредниот прајмер ја содржи комплементарната низа на промоторот Т7.За време на реакцијата, напредниот прајмер се врзува за РНК жицата и се катализира од ензимот AMV за да формира ДНК-РНК двојна верига.

RNase H ја дигестира РНК во хибридната дво-верижна и ја задржува едноверижната ДНК.

Под дејство на обратниот прајмер и AMV ензимот, се формира двојна нишка на ДНК која ја содржи промотерската секвенца Т7.

Под дејство на Т7 РНК полимеразата, процесот на транскрипција е завршен и се произведува голема количина целна РНК.

Предности на NASBA:

(1) Неговиот прајмер има промоторна секвенца Т7, но странската двоверижна ДНК нема промоторна секвенца Т7 и не може да се засили, така што оваа технологија има висока специфичност и чувствителност.

(2) NASBA директно го инкорпорира процесот на обратна транскрипција во реакцијата на засилување, скратувајќи го времето на реакција.

Недостатоци на NASBA:

(1) Реакционите компоненти се покомплицирани.

(2) Потребни се три вида ензими за да се зголеми цената на реакцијата.