Вредноста на Ct е најважната форма на презентација на резултатот на флуоресцентната квантитативна PCR.Се користи за пресметување на разликите во генската експресија или бројот на копијата на гените.Значи, која е вредноста на Ct на квантификацијата на флуоресценцијата која се смета за разумна?Како да се обезбеди ефективен опсег на Ct вредност?
Што е Ct вредност?
За време на процесот на засилување qPCR, соодветниот број на циклуси на засилување (Циклен праг) кога флуоресцентниот сигнал на засилениот производ ќе го достигне зададениот праг на флуоресценција.C значи Циклус, а Т е праг.Едноставно кажано, вредноста на Ct е бројот на циклуси што одговараат на кога иницијалното засилување на шаблонот ќе достигне одредена количина производ во qPCR.Таканаречената „одредена количина на производ“ ќе биде дополнително објаснета подоцна.
Што прави вредноста на Ct?
1. Врска помеѓу експоненцијално засилување, износот на шаблонот и вредноста на Ct
Идеално, гените во qPCR се акумулираат со експоненцијално засилување по одреден број циклуси.Врската помеѓу бројот на циклуси на засилување и количината на производи е: Засилена количина на производ = почетна количина на шаблон × (1+En) број на циклуси.Сепак, qPCR реакцијата не е секогаш во идеална ситуација.Кога количината на засилениот производ достигне „одреден износ на производ“, бројот на циклуси во овој момент е вредноста на Ct и е во периодот на експоненцијално засилување.Односот помеѓу вредноста Ct и износот на почетната шаблон: Постои линеарна врска помеѓу вредноста Ct на шаблонот и логаритамот на бројот на почетната копија на шаблонот.Колку е поголема почетната концентрација на шаблонот, толку е помала вредноста на Ct;колку е помала почетната концентрација на шаблонот, толку е поголема вредноста на Ct.
2. Крива на засилување, праг на флуоресценција и одредена количина на PCR производ
Количината на производот за засилување qPCR е директно претставена во форма на флуоресцентен сигнал, односно крива на засилување.Во раната фаза на PCR, засилувањето е под идеални услови, бројот на циклуси е мал, акумулацијата на производот е мала, а нивото на флуоресценција не може јасно да се разликува од флуоресцентната позадина.После тоа, флуоресценцијата се зголемува и влегува во експоненцијалната фаза.Количеството на PCR производ може да се открие во одреден момент кога PCR реакцијата е само во експоненцијална фаза, која може да се користи како „одредена количина на производ“, и од ова може да се заклучи почетната содржина на шаблонот.Затоа, интензитетот на флуоресцентниот сигнал што одговара на одредена количина на производ е праг на флуоресценција.
Во доцната фаза на PCR, кривата на засилување повеќе не покажува експоненцијално засилување, и влегува во линеарната фаза и фазата на плато.
3.Репродуктивност на Ct вредности
Кога циклусот на PCR ќе го достигне бројот на циклусот на вредноста на Ct, тој штотуку влегол во вистинскиот експоненцијален период на засилување.Во овој момент, малата грешка не е засилена, така што репродуктивноста на вредноста на Ct е одлична, односно истиот шаблон се засилува во различни времиња или во различни цевки во исто време.Засилување, добиената Ct вредност е константна.
1.Ефикасност на засилување En
Ефикасноста на засилување на PCR се однесува на ефикасноста со која полимеразата го претвора генот што треба да се засили во ампликон.Ефикасноста на засилување кога една молекула на ДНК се трансформира во две ДНК молекули е 100%.Ефикасноста на засилување најчесто се изразува како En.Со цел да се олесни анализата на следните статии, накратко се воведени факторите кои влијаат на ефикасноста на засилувањето.
| Влијателни фактори | објаснување | Како да се суди? |
| A. PCR инхибитори | 1. Шаблонот ДНК содржи супстанции кои ја инхибираат реакцијата на PCR, како што се протеини или детергенти.2. cDNA по обратна транскрипција содржи висока концентрација на компоненти на шаблон RNA или RT реагенс, што исто така може да ја инхибира последователната PCR реакција. | 1. Дали има загадување може да се процени со мерење на односот на A260/A280 и A260/A230 или РНК електрофореза.2. Дали cDNA е разредена според одреден сооднос по обратна транскрипција. |
| Б. Несоодветен дизајн на прајмер | Прајмерите не се бришат ефикасно | Проверете ги прајмерите дали има прајмер-димери или шноли, неусогласени и понекогаш опфатени интронски дизајни. |
| В. Неправилно дизајнирање на програма за реакција на PCR | 1. Прајмерите не можат ефикасно да се анектираат2. Недоволно ослободување на ДНК полимераза 3. Долгорочната активност на ДНК полимеразата на висока температура е намалена | 1. Температурата на жарење е повисока од TM вредноста на прајмерот2. Времето за пред денатурација е прекратко 3. Времето на секоја фаза од постапката на реакција е премногу долго |
| Г. Недоволно мешање на реагенси или грешки во пипетирањето | Во системот на реакција, локалната концентрација на компонентите на PCR реакцијата е премногу висока или нерамна, што резултира со неекспоненцијално засилување на PCR засилувањето | |
| E. Должина на ампликон | Должината на засилувачот е премногу долга, надминува 300 bp, а ефикасноста на засилување е мала | Проверете дали должината на засилувачот е помеѓу 80-300bp |
| F. Влијание на qPCR реагенси | Концентрацијата на ДНК полимеразата во реагенсот е ниска или концентрацијата на јоните во пуферот не е оптимизирана, што резултира со ензимската активност Taq да не го достигне максимумот | Одредување на ефикасноста на засилување со стандардна крива |
2. Опсег на Ct вредности
Вредностите на Ct се движат од 15-35.Ако вредноста на Ct е помала од 15, се смета дека засилувањето е во опсегот на основниот период и дека прагот на флуоресценција не е достигнат.Идеално, постои линеарна врска помеѓу вредноста на Ct и логаритмот на бројот на почетната копија на шаблонот, односно стандардната крива.Преку стандардната крива, кога ефикасноста на засилување е 100%, пресметаната вредност на Ct за квантифицирање на бројот на една копија на генот е околу 35. Ако е поголем од 35, почетниот број на копии на шаблонот теоретски е помал од 1, што може да се смета за бесмислено.
За различни генски Ct опсези, поради разликата во бројот на копијата на генот и ефикасноста на засилување во почетната количина на шаблонот, неопходно е да се направи стандардна крива за генот и да се пресмета линеарното откривање на генот.
3.Влијателни фактори на Ct вредност
Од односот помеѓу бројот на циклуси на засилување и количината на производот: количина на засилен производ = количина на почетниот шаблон × (1+En) број на циклус, може да се види дека при идеални услови, количината на почетниот шаблон и En ќе имаат негативно влијание врз вредноста на Ct е засегната.Разликата во квалитетот на шаблонот или ефикасноста на засилување ќе предизвика вредноста на Ct да биде преголема или премала.
4.Ct вредноста е преголема или премала
Време на објавување: 22-2-2023 година
