Технологијата за молекуларна дијагноза користи методи на молекуларна биологија за откривање на изразот и структурата на генетскиот материјал на човечкото тело и различни патогени, со цел да се постигне целта за предвидување и дијагностицирање на болести.

Во последниве години, со надградбата и повторувањето на технологијата за молекуларна дијагностика, клиничката примена на молекуларната дијагностика станува сè пообемна и подлабока, а пазарот на молекуларна дијагностика влезе во период на брз развој.

Авторот ги сумира заедничките молекуларни дијагностички технологии на пазарот и е поделен на три дела: првиот дел ја воведува технологијата PCR, вториот дел ја воведува технологијата за изотермално засилување на нуклеинската киселина, а вториот дел ја воведува технологијата на секвенционирање.

01

Дел I: PCR технологија

PCR технологија

PCR (полимеразна верижна реакција) е една од ин витро технологиите за засилување на ДНК, со историја од повеќе од 30 години.

PCR технологијата беше пионер во 1983 година од страна на Кари Мулис од Цетус, САД.Мулис аплицираше за ПЦР патент во 1985 година и го објави првиот академски труд за ПЦР за Наука во истата година.Мулис ја доби Нобеловата награда за хемија во 1993 година.

Основни принципи на PCR

PCR може да ги засили целните фрагменти на ДНК за повеќе од еден милион пати.Принципот е дека при катализа на ДНК полимераза, матичната нишка ДНК се користи како шаблон, а специфичен прајмер се користи како почетна точка за проширување.Се реплицира ин витро преку чекори како што се денатурација, жарење и екстензија.Процесот на ДНК од ќеркичка нишка комплементарен на образецот на матичната нишка ДНК.

Стандардниот процес на PCR е поделен на три чекори:

1. Денатурација: Користете висока температура за да ги одделите двојните нишки на ДНК.Водородните врски помеѓу двојните нишки на ДНК се прекинуваат на високи температури (93-98°C).

2. Греење: Откако ќе се одвои двоверижна ДНК, температурата се намалува за да може прајмерот да се врзе за едноверижната ДНК.

3. Екстензија: ДНК полимеразата започнува да синтетизира комплементарни нишки долж ДНК нишките од прајмерите врзани кога температурата е намалена.Кога продолжувањето е завршено, циклусот е завршен, а бројот на фрагменти на ДНК се удвојува.

Повторувајќи ги овие три чекори 25-35 пати, бројот на фрагменти на ДНК експоненцијално ќе се зголеми.

Генијалноста на PCR е во тоа што различни прајмери ​​може да се дизајнираат за различни целни гени, така што целните генски фрагменти може да се засилат за краток временски период.

Досега, PCR може да се подели во три категории, имено обичен PCR, флуоресцентен квантитативен PCR и дигитален PCR.

Првата генерација на обичен PCR

Користете обичен инструмент за засилување на PCR за да го засилите целниот ген, а потоа користете електрофореза со гел агароза за да го откриете производот, може да се направи само квалитативна анализа.

Главните недостатоци на првата генерација на PCR:

-Склони кон неспецифично засилување и лажно позитивни резултати.

-Откривањето трае долго, а операцијата е гломазна.

-Може да се направи само квалитативно тестирање.

Флуоресцентна квантитативна PCR од втора генерација

Флуоресцентниот квантитативен PCR (PCR во реално време), исто така познат како qPCR, се користи за следење на акумулацијата на засилени производи преку акумулација на флуоресцентни сигнали со додавање на флуоресцентни сонди кои можат да го покажат напредокот на системот за реакција и да ги проценат резултатите преку кривата на флуоресценција и може да се квантифицира со помош на стандардната вредност C.

Бидејќи qPCR технологијата се изведува во затворен систем, веројатноста за контаминација е намалена, а флуоресцентниот сигнал може да се следи за квантитативно откривање, па затоа е најшироко користена во клиничката пракса и стана доминантна технологија во PCR.

Флуоресцентните супстанции што се користат во флуоресцентна квантитативна PCR во реално време може да се поделат на: TaqMan флуоресцентни сонди, молекуларни светилници и флуоресцентни бои.

1) TaqMan флуоресцентна сонда:

За време на PCR засилување, се додава специфична флуоресцентна сонда додека се додава пар прајмери.Сондата е олигонуклеотид, а двата краја се соодветно означени со известувачка флуоресцентна група и флуоресцентна група за гаснење.

Кога сондата е недопрена, флуоресцентниот сигнал емитиран од групата известувач се апсорбира од групата за гаснење;за време на PCR засилување, активноста на 5'-3' егзонуклеаза на ензимот Taq ја расцепува и деградира сондата, со што известувачката флуоресцентна група и гаси. флуоресцентниот сигнал е целосно синхронизиран со формирањето на производот PCR.

2) SYBR флуоресцентни бои:

Во системот за реакција на PCR, се додава вишок на SYBR флуоресцентна боја.Откако флуоресцентната боја SYBR е неспецифично инкорпорирана во двојната жица на ДНК, таа емитува флуоресцентен сигнал.Молекулата на бојата SYBR што не е инкорпорирана во синџирот нема да емитува никаков флуоресцентен сигнал, со што ќе се осигури дека флуоресцентниот сигнал Зголемувањето на производите на PCR е целосно синхронизирано со зголемувањето на PCR производите.SYBR се врзува само за двоверижна ДНК, така што кривата на топење може да се користи за да се утврди дали реакцијата на PCR е специфична.

3) Молекуларни светилници

Тоа е двојна означена олигонуклеотидна сонда со стебло-јамка која формира структура на фиба од околу 8 бази на 5-от и 3-от крај.Нуклеинските киселински секвенци на двата краја се комплементарно спарени, што предизвикува флуоресцентната група и групата за гаснење да бидат затегнати.Затвори, нема да произведува флуоресценција.

Откако ќе се генерира производот на PCR, за време на процесот на жарење, средниот дел од молекуларниот светилник е спарен со специфична ДНК секвенца, а флуоресцентниот ген се одвојува од генот за гаснење за да произведе флуоресценција.

Главните недостатоци на PCR од втората генерација:

Сè уште недостасува чувствителност, а откривањето на примероци со ниска копирање не е точно.

Има влијание на позадинската вредност и резултатот е подложен на пречки.

Трета генерација дигитален PCR

Дигитален PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) го пресметува бројот на копии на целната секвенца преку откривање на крајната точка и може да изврши точна апсолутна квантитативна детекција без користење на внатрешни контроли и стандардни криви.

Дигиталната PCR користи откривање на крајната точка и не зависи од вредноста на Ct (праг на циклусот), така што дигиталната PCR реакција е помалку засегната од ефикасноста на засилување, а толеранцијата кон инхибиторите на реакцијата на PCR е подобрена, со висока точност и репродуктивност.

Поради карактеристиките на висока чувствителност и висока точност, не е лесно да се мешаат со инхибитори на PCR реакција и може да се постигне вистинска апсолутна квантификација без стандардни производи, што стана жариште за истражување и примена.

Според различните форми на единицата за реакција, таа може да се подели на три вида: микрофлуидни, чипови и системи со капки.