Во експериментите qPCR, дизајнот на прајмерот е исто така многу важна врска.Дали прајмерите се соодветни или не е тесно поврзано со тоа дали ефикасноста на засилување го достигнува стандардот, дали засилените производи се специфични и дали се достапни експерименталните резултати.
Значи, како да се подобри специфичноста на прајмерот qPCR?Висока ефикасност на засилување?
Денес, ќе ве одведеме заедно да дизајнирате qPCR прајмери ​​и да дозволиме дизајнот на прајмерот qPCR да стане ефикасна вештина во експериментите.
При дизајнирање на qPCR прајмери, обично обрнувајте внимание на следниве точки: прајмерите треба да бидат дизајнирани по интрони колку што е можно повеќе, должината на производот треба да биде 100-300 bp, вредноста на Tm треба да биде што е можно поблиску до 60°C, а прајмерите нагоре и надолу треба да бидат што е можно поблиску, а крајот на прајмерот треба да чека G или C итн.
1. Дизајн на прајмери ​​кои опфаќаат интрони
При дизајнирање на qPCR прајмери, изборот на прајмери ​​дизајнирани преку интрони може да спречи засилување на шаблонот gDNA, а сите производи се добиени од засилување на cDNA, со што се елиминира влијанието на контаминацијата на gDNA.
2. Должина на прајмер
Должината на прајмерот е генерално помеѓу 18-30 nt, а должината на производот за засилување треба да се контролира помеѓу 100-300 bp колку што е можно повеќе.
Ако прајмерот е премногу краток, тоа ќе доведе до неспецифично засилување, а ако е премногу долг, лесно ќе формира секундарна структура (како што е структурата на фиба).Ако производот за засилување е премногу долг, тој не е погоден за реакција на полимераза, што ќе влијае на ефикасноста на PCR засилувањето.
3. GC содржина и Tm вредност
Содржината на GC на прајмерите треба да се контролира помеѓу 40% и 60%.Ако е премногу висока или премногу ниска, не е погодна за започнување на реакцијата.Содржината на GC на предниот и на обратниот прајмер треба да биде блиску до истата за да се добие истата вредност на Tm и температура на жарење.
Вредноста на Tm треба да биде помеѓу 55-65°C колку што е можно повеќе, генерално околу 60°C, а вредноста на Tm на возводно и низводно треба да биде што е можно поблиску, по можност не повеќе од 4°C.
4. Избегнувајте да изберете А на 3′ крајот на прајмерот
Кога 3' крајот на прајмерот не се совпаѓа, постојат големи разлики во ефикасноста на синтезата на различни бази.Кога последната основа е А, таа исто така може да иницира синтеза на синџир дури и во случај на несовпаѓање, а кога последната основа е T Кога , ефикасноста на индукцијата на несовпаѓање е значително намалена.Затоа, обидете се да го избегнете изборот на А на 3′ крајот на прајмерот, а подобро е да изберете Т.
Ако се работи за прајмер на сонда, 5' крајот на сондата не може да биде G, бидејќи дури и кога една G база е поврзана со FAM флуоресцентната репортерска група, G исто така може да го угаси флуоресцентниот сигнал што го емитува групата FAM, што резултира со лажно негативни резултати.Се појави.
5. Основна дистрибуција
Распределбата на четирите бази во прајмерот е по можност случајна, избегнувајќи повеќе од 3 последователни G или C на крајот од 3' и повеќе од 3 последователниG или C лесно се генерира спарување во регионот на секвенца богата со GC.
6. Регионот за дизајн на прајмер треба да избегнува сложени секундарни структури.
Секундарната структура формирана од единечната жичка на производот за засилување ќе влијае на непречениот напредок на PCR.Со однапред предвидување дали има секундарна структура во целната низа, обидете се да го избегнете овој регион при дизајнирањето на прајмери.
7. Самите прајмери ​​и помеѓу прајмерите треба да се обидат да избегнуваат последователни комплементарни основи.
Не може да има последователна комплементарност со 4 бази помеѓу самиот прајмер и прајмерот.Самиот прајмер не треба да има комплементарна низа, во спротивно ќе се превиткува за да формира структура на фиба, што ќе влијае на комбинацијата на жарење на прајмерот и шаблонот.
Комплементарни секвенци не можат да постојат помеѓу прајмерите нагоре и надолу.Комплементарноста помеѓу прајмерите ќе произведе прајмер димери, што ќе ја намали ефикасноста на PCR, па дури и ќе влијае на квантитативната точност.Ако структурите на прајмер-димер и фиба се неизбежни, вредноста △G не треба да биде премногу висока (треба да биде помала од 4,5 kcal/mol).
8. Прајмерите го засилуваат целниот специфичен производ.
Крајната цел на qPCR детекцијата е да се разбере изобилството на целниот ген.Ако се појави неспецифично засилување, квантификацијата ќе биде неточна.Затоа, откако ќе се дизајнираат прајмерите, тие треба да се тестираат со BLAST, а специфичноста на производите се споредува во базата на податоци за секвенци.
Следно, го земаме човечкиот GAS6 (Специфичен 6 запирање на растот) ген како пример за дизајнирање на qPCR прајмери.
01 ген за пребарување
Хомо ГАС6преку NCBI .Овде, треба да обрнеме внимание на споредување на името на генот и видовите за да се осигураме дека тие се конзистентни.
02 Најдете ја генската секвенца
(1) Ако целната секвенца е геномска ДНК, изберете ја првата, која е геномската ДНК секвенца на генот.
(2) Ако целната секвенца е mRNA, изберете ја втората.Откако ќе го внесете, кликнете на „CDS“ во табелата подолу.Секвенцата на кафеава позадина е кодирана секвенца на генот.
03 Дизајн прајмери
Внесете го интерфејсот Primer-BLAST
Внесете го бројот на генската секвенца или секвенцата во формат Fasta горе лево и пополнете ги соодветните параметри.

Кликнете на „Земи прајмери“ и NCBI ќе се појави за да ви каже дека таквиот избор на параметри ќе се засили со други варијанти на спојување.Можеме да ги провериме различните варијанти на спојување и да ги поднесеме за да го добиеме соодветниот пар на прајмери ​​(како што е прикажано на сликата подолу).Овој процес може да трае десетици секунди.
Температурите на жарење на овие парови на прајмери ​​се околу 60°C.Според целта на експериментот, изберете прајмери ​​со умерена должина, добра специфичност и помалку самокомплементација на прајмерите за експериментот, а стапката на успех е доста висока!
04Потврда на специфичноста на прајмерот
Всушност, освен дизајнирање на прајмери, Primer-Blast може да ги процени и прајмерите што самите ги дизајниравме.Вратете се на страницата за дизајн на прајмер, внесете ги прајмерите нагоре и низводно што ги дизајниравме и другите параметри нема да се приспособат.По поднесувањето, можете да видите дали парот прајмери ​​постои и на други гени.Ако сите тие се прикажани на генот што сакаме да го засилиме, што покажува дека специфичноста на овој пар прајмери ​​е одлична!(На пример, ова е единствениот резултат од барањето за буквар!)

05 Проценка за квалитетот на буквар
Каков вид прајмер е „совршениот“ прајмер што комбинира „ефикасност на засилување до стандард“, „засилени карактеристики на производот“ и „сигурни експериментални резултати“?
Ефикасност на засилување

крива на топење
Ефикасноста на засилување на прајмерите достигнува 90%-110%, што значи дека ефикасноста на засилување е добра, а кривата на топење има единечен врв и обично Tm>80°C, што значи дека специфичноста на засилување е добра.
 
Поврзани производи:
Во реално време PCR Easy–SYBR GREEN I
Во реално време PCR Easy-Taqman