Флуоресцентна квантитативна PCR (исто така позната како TaqMan PCR, во понатамошниот текст FQ-PCR) е нова квантитативна технологија на нуклеинска киселина развиена од PE (Perkin Elmer) во САД во 1995 година. Оваа технологија се заснова на конвенционална PCR со додавање на флуоресцентни означени сонди.Во споредба со флексибилниот PCR, FQ-PCR има многу предности за да ја реализира својата квантитативна функција.Оваа статија има намера накратко да ги опише карактеристиките, принципите, методите и примената на технологијата.
1 Карактеристики
FQ-PCR не само што ја има високата чувствителност на обичниот PCR, туку и поради примената на флуоресцентни сонди, може директно да ја открие промената на флуоресцентниот сигнал за време на PCR засилување преку системот за фотоелектрична спроводливост за да добие квантитативни резултати, со што се надминуваат многу недостатоци на конвенционалната PCR, така што исто така има висока специфичност на технологијата и високата специфичност на ДНК хикурос
На пример, општите PCR производи треба да се набљудуваат со електрофореза на гел агароза и боење со етидиум бромид со ултравиолетова светлина или со електрофореза на полиакриламид гел и боење со сребро.Ова не само што бара повеќе инструменти, туку бара и време и напор.Дамките што се користат Етидиум бромид се штетни за човечкото тело, а овие комплицирани експериментални процедури даваат можности за загадување и лажни позитиви.Сепак, FQ-PCR треба да го отвори капакот само еднаш за време на вчитувањето на примерокот, а последователниот процес е целосно операција со затворена цевка, која не бара пост-обработка на PCR, избегнувајќи многу недостатоци во конвенционалните PCR операции.Експериментот генерално го користи термичкиот циклер ABI7100 PCR развиен од компанијата PE.
Инструментот ги има следните карактеристики: ① Широка примена: Може да се користи за квантификација на ДНК и РНК ПЦР производи, истражување на генската експресија, откривање на патогени и оптимизација на условите за ПЦР.② Единствен квантитативен принцип: Со користење на флуоресцентно означени сонди, количината на флуоресценција ќе се акумулира со циклусот на PCR по ласерското возбудување, за да се постигне целта на квантификација.③ Висока работна ефикасност: Вграден 9600 PCR термички циклус, компјутерски контролиран 1 до 2 часа за да се заврши засилувањето и квантификацијата на 96 примероци автоматски и синхроно.④ Нема потреба од гел електрофореза: Нема потреба да се разредува и електрофореза примерокот, само користете специјална сонда за да откриете директно во реакционата цевка.⑤Без загадување во гасоводот: Уникатната целосно затворена реакциона цевка и фотоелектричен систем за спроводливост се усвоени, така што нема потреба да се грижите за загадувањето.⑥ Резултатите се репродуцираат: квантитативниот динамички опсег е до пет реда на големина.Затоа, откако оваа технологија беше успешно развиена, таа беше ценета од многу научни истражувачи и беше применета во многу области.
2 Принципи и методи
Принципот на работа на FQ-PCR е да се користи 5'→3' егзонуклеазна активност на ензимот Taq за да се додаде флуоресцентно означена сонда во системот за реакција на PCR.Сондата може специфично да се хибридира со шаблонот на ДНК содржан во прајмерната секвенца.5'крајот на сондата е означен со генот за емисии на флуоресценција FAM (6-карбоксифлуоресцеин, врв на емисија на флуоресценција на 518nm), а 3'крајот е означен со Групата за гаснење на флуоресценција TAMRA (6-carboxytetramethylfluoreginsence5), сондата е фосфорилирана за да се спречи проширувањето на сондата за време на PCR засилување.Кога сондата останува недопрена, групата за гаснење ја потиснува флуоресцентната емисија на групата што емитува.Штом емитирачката група ќе се одвои од групата за гаснење, инхибицијата се укинува, а оптичката густина на 518 nm се зголемува и е откриена од системот за детекција на флуоресцентна.Кога сондата е отсечена, ефектот на гаснење се ослободува и флуоресцентниот сигнал се ослободува.Секогаш кога се копира шаблонот, се отсекува сонда, придружена со ослободување на флуоресцентен сигнал.Бидејќи постои врска еден-на-еден помеѓу бројот на ослободени флуорофори и бројот на PCR производи, оваа техника може да се користи за прецизно квантифицирање на шаблонот.Експерименталниот инструмент генерално го користи термичкиот циклер ABI7100 PCR развиен од компанијата PE, а може да се користат и други термоциклери.Доколку за експериментот се користи системот за реакција од типот на реакција ABI7700, по завршувањето на реакцијата, квантитативните резултати може директно да се дадат преку компјутерска анализа.Ако користите други термички циклери, треба да користите детектор за флуоресценција за да го измерите флуоресцентниот сигнал во реакционата цевка во исто време за да пресметате RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ го претставува односот на интензитетот на луминисценцијата на групата на флуоресцентни емисии на цевката за примерок со интензитетот на луминисценција на групата за гаснење, RQ- го претставува односот на двете во празната цевка, △RQ (△RQ=RQ+-RQ+-количеството на податоци за процесирање на флуитуирање, количеството на луминисценција на-) може да се добијат.Поради воведувањето на флуоресцентни сонди, специфичноста на експериментот е значително подобрена.Дизајнот на сондата генерално треба да ги исполнува следните услови: ① Должината на сондата треба да биде околу 20-40 бази за да се обезбеди специфичноста на врзувањето.②Содржината на GC базите е помеѓу 40% и 60% за да се избегне дуплирање на единечни нуклеотидни секвенци.③ Избегнувајте хибридизација или преклопување со прајмери.④ Стабилноста на врзувањето помеѓу сондата и шаблонот е поголема од стабилноста на врзувањето помеѓу прајмерот и шаблонот, така што вредноста на Tm на сондата треба да биде најмалку 5°C повисока од вредноста на Tm на прајмерот.Дополнително, концентрацијата на сондата, хомологијата помеѓу сондата и редоследот на шаблонот и растојанието помеѓу сондата и прајмерот имаат влијание врз експерименталните резултати.
Поврзани производи:
Кина во реално време PCR Easyᵀᴹ-Taqman Производител и добавувач |Foregene (foreivd.com)
Време на објавување: 15-10-2021 година
