Верувам дека секој секогаш ќе наиде на вакви или такви проблеми кога прави PCR реакции, но повеќето од нив може да се класифицираат во два главни проблеми:

Премалку засилување на генетскиот шаблон (засилување);
Премногу амплификација на нецелен ген.
Користењето адитиви е една од вообичаените стратегии за решавање на овие проблеми.Обично улогата на адитивите има два аспекта:
секундарна структурана гени (секундарна структура);
Намалете го неспецифичното грундирање.
Денес уредникот накратко ќе ви ги претстави вообичаените адитиви во PCR реакциите и нивните функции.
Адитиви кои ја намалуваат секундарната структура
сулфоксид(DMSO)
генски примероцисо висока содржина на GC .Сепак, DMSO, исто така, во голема мера ја намалува активноста на Taq полимеразата.Затоа, секој мора да ја балансира пристапноста на шаблонот и активноста на полимеразата.Уредникот сугерира дека можете да пробате различни концентрации на DSMO, како од 2% до 10%, за да ја пронајдете концентрацијата што одговара на вашиот експеримент.
Нејонски детергенти
Нејонските детергенти, како што се 0,1-1% Triton X-100, Tween 20 или NP-40, обично ја намалуваат секундарната структура на ДНК.Иако ова може да го зголеми засилувањето на генот на шаблонот, исто така ќе предизвика проблеми со неспецифично засилување.Значи, овие адитиви работат добро за PCR реакции со низок принос без остатоци, но не толку добро за релативно нечисти реакции на PRC.Друга придобивка од нејонските детергенти е намалувањето на контаминацијата со SDS.Вообичаено за време на процесот на екстракција на ДНК, SDS ќе биде доведен до чекорот на PCR, што во голема мера ја инхибира активноста на полимеразата.Затоа, додавањето на 0,5% Tween-20 или Tween-40 на реакцијата може да ги неутрализира негативните ефекти на SDS.
Бетаин_
Бетаинот може да го подобри засилувањето на ДНК со намалување на формирањето на секундарна структура и генерално е „мистериозен“ додаток на комерцијалните PCR комплети.Ако сакате да користите бетаин, треба да ставите бетаин или бетаин монохидрат (бетаин или бетаин монохидрат), но не и бетаин хидрохлорид (бетаин HCl), приспособете се на конечна концентрација од 1-1,7 М.Бетаинот, исто така, може да помогне во подобрувањето на специфичноста бидејќи ја елиминира зависноста од составот на базниот пар од топење на ДНК/денатурација на ДНК.
Адитиви за намалување на неспецифично грундирање
Формамид
Формамидот е најчесто користен органски PCR додаток.Може да се комбинира со голем жлеб и помал жлеб во ДНК, со што се намалува стабилноста на двојната спирала на главната ДНК и се намалува температурата на топење на ДНК.Концентрацијата на формамид што се користи во експериментите со PCR е обично 1%-5%.
Тетраметиламониум хлорид( TMAC)
Тетраметиламониум хлорид може да ја зголеми специфичноста на хибридизацијата (специфичност на хибридизација) и да ја зголеми температурата на топење на ДНК.Така, TMAC може да го отстрани неспецифичното прајминг и да го намали погрешното врзување на ДНК и РНК.Доколку користитедегенерирани прајмериво реакцијата на PCR, не заборавајте да додадете TMAC, кој вообичаено се користи во концентрација од 15-100 mM.
Други вообичаени адитиви
Покрај двете категории на адитиви споменати погоре, постојат многу вообичаени адитиви во PCR реакциите, иако тие имаат различни функции, тие се исто така многу важни.
Магнезиум јон
Магнезиумовиот јон е незаменлив кофактор (кофактор) на полимеразата, односно без јон на магнезиум, полимеразата е неактивна.Сепак, премногу јони на магнезиум, исто така, може да влијае на ефикасноста на полимеразата.Концентрацијата на јони на магнезиум во секоја PCR реакција ќе варира.Хелативните агенси (како што се EDTA или цитрат), концентрацијата на dNTP и протеините, сите влијаат на концентрацијата на јоните на магнезиум.Значи, ако имате проблеми со вашиот PCR експеримент, можете да се обидете да промените различни концентрации на јони на магнезиум, на пример, од 1,0 до 4,0 mM, со интервал од 0,5-1 mM помеѓу.
Вреди да се напомене дека повеќекратните циклуси на замрзнување-одмрзнување може да доведат до стратификација на концентрацијата на растворот на магнезиум хлорид.Затоа, мора целосно да го растворите пред секоја употреба и добро да го измешате пред да го користите.
Говедски серумски албумин(Говедски албумин, BSA)
Во експериментите со молекуларна хемија, говедскиот серумски албумин е многу чест додаток, особено во експериментите со дигестија со рестриктивни ензими и PCR.Во PCR реакциите, BSA помага во намалувањето на загадувачите како што се фенолните соединенија.Исто така, се вели дека може да ја намали адхезијата на реактантите на ѕидот на епрувета.Во реакцијата на PCR, обично концентрацијата на додадена BSA може да достигне 0,8 mg/ml.
 
Поврзани производи:
PCR херој(со боја)
PCR херој