Потврдувањето на перформансите на прајмерите и сондите во раната фаза на PCR реагенсите и одредувањето на најсоодветните услови за реакција се предусловите за да се обезбеди непречено напредување на формалните експерименти.
Значи, како треба да ја потврдиме сондата за прајмер во раната фаза?
Главните показатели се основната линија, кривата на засилување, вредноста на ct, ефикасноста на засилување, откривањето на примерокот со ниска концентрација, CV, итн.
Основна линија
Основната линија е хоризонталната линија во кривата за засилување на PCR.Во првите неколку циклуси на реакцијата за засилување на PCR, флуоресцентниот сигнал не се менува многу и формира права линија.Оваа права линија е основната линија.
При скрининг на PCR прајмерните сонди, обрнете внимание на тоа дали основната линија е на ниво.Чистотата на концентрацијата на прајмерната сонда ќе влијае на основната линија, како што е предизвикување на основната линија да расте или опаѓа.Основната линија е исто така многу интуитивен индикатор.
Крива на засилување
Друг интуитивен индикатор е обликот на кривата на засилување.Најдобро е да се има крива во форма на S за да се избегне секундарно засилување или други абнормални криви на засилување.
Вредност Ct
Бројот на циклуси што одговараат на точката на флексија од основната линија до експоненцијалниот раст е вредноста на Ct.
За истиот примерок, различни прајмерни сонди резултираат со различни криви на засилување, а соодветната вредност на Ct ќе биде под влијание на ефикасноста на засилување и степенот на интерференција.Во теорија, колку е помала вредноста на Ct на сондата за прајмер што ја избираме, толку подобро.
Ефикасност на засилување
Еден од најсигурните и најстабилните методи за евалуација на ефикасноста на засилување на PCR е стандардната крива, која исто така е широко препознаена од истражувачите.Методот вклучува правење серија примероци за контрола на релативниот број на целни шаблони.Овие примероци обично се прават со сериски разредувања на концентрирани матични раствори, најчесто се користи 10-кратно разредување.Со користење на серија разредени примероци, со користење на стандардна програма qPCR за засилување за да се добие вредноста на Cq, и на крајот да се нацрта стандардна крива според концентрацијата на секој примерок и соодветната вредност на Cq за да се добие линеарната равенка Cq= -klgX0+b, и ефикасноста на засилување E=10(-1 /k)-1.Кога се користи qPCR за квантитативна анализа, потребно е ефикасноста на засилување да биде во опсег од 90%-110% (3,6>k>3,1).
Детекција на примероци со ниска концентрација
Кога концентрацијата на примерокот е ниска, стапките на откривање на различни прајмерни сонди се различни.Избираме 20 примероци со ниска концентрација за реплицирање, а системот со прајмер-сонда со најголема стапка на откривање е најдобар.
Коефициент на варијација (CV)
10 дупликати примероци може да се детектираат со различни прајмерни сонди според стандардот на линијата на реагенсот за откривање на засилување на нуклеинската киселина.
Квантитативни реагенси:
Точност
Точноста во една серија треба да одговара: коефициентот на варијација (CV,%) на логаритамската вредност на тест концентрацијата е ≤5%.Кога концентрацијата на примерокот е ниска, коефициентот на варијација (CV,%) на логаритмот на концентрацијата на детекција е ≤10%
Квалитативни реагенси:
Точност
Точноста во една серија треба да одговара:
(1) Коефициент на варијација на Ct вредност (CV,%) ≤5%
Истиот примерок се тестира паралелно 10 пати, а резултатите од тестот треба да бидат конзистентни
Време на објавување: 18-ти септември 2021 година
