Автори: Ванг Ксијаојан, Жао Ериу

Единица: болница Џиаожу, болница Донгфанг поврзана со Универзитетот Тонги

Во моментов, главниот тип на примерок за откривање на респираторниот патоген нуклеинска киселина е брис од грло.Постојат многу видови на најчесто користени раствори за зачувување примероци, од кои сите треба да се чуваат во фрижидер или замрзнати за транспорт и складирање;Тешко е да се контролира целиот процес на ниска температура за време на процесот на собирање и транспорт, и тешко е да се обезбеди контрола на квалитетот пред тестирањето на примерокот^[1-2].

RNase (RNase) е ендонуклеаза која ја хидролизира РНК, главно прекинувајќи ги фосфодиестерските врски помеѓу нуклеотидите.Молекулата на RNase е многу стабилна, има дисулфидни врски во структурата и за нејзината активност не е потребно присуство на двовалентни катјони, така што RNase не е лесно денатурирана, а лесно се ренатурира дури и по висока температура или употреба на денатуранти.RNases се поделени на ендогени и егзогени.Ендогените RNase може да се ослободат во исто време кога клетките се пукнати.Затоа, елиминирањето на улогата на ендогените RNase е многу критичен чекор во процесот на екстракција на РНК.Егзогени RNase се широко распространети.RNases постојат во воздухот, човечката кожа, косата и плунката, кои се важни причини за лесно разградување на РНК^[3].

Барање податоци

CANS-CL02-A009 „Примена на упатства за акредитација на квалитет и компетентност во медицинската лабораторија во областа на молекуларната дијагностика“ во техничките барања предлага соодветните стандарди за квалитет на водата да се формулираат според апликацијата;Херметички контејнери за еднократна употреба:

RNase/Класификација

(1) RNase A

Рибонуклеазата А (RNase A), добиена од говедскиот панкреас, е ендорибонуклеаза која конкретно може да го нападне 3' крајот на остатоците од пиримидин на РНК, сечење на цитозин или урацил формирани од соседните нуклеотиди.Фосфодиестерска врска, финалниот производ на реакцијата е 3' пиримидински нуклеотид и олигонуклеотид со 3' пиримидински нуклеотид на крајот.

(2) RNase T1

Рибонуклеазата Т1 (RNase T1) е изведена од Aspergillus orjzae, таа специфично делува на 3'-терминалниот фосфат на гванин, а местото на расцепување е помеѓу 3' фосфатот на гванин и 5' хидроксилот на соседните нуклеотиди.Крајниот производ на реакцијата е 3'гванилна киселина и фрагменти од олигонуклеотиди со 3'гванилна киселина на крајот.

(3) RNase H

Рибонуклеазата H (RNase H) првпат била откриена од ткивото на тимусот на теле, а неговиот ген за кодирање е клониран во Escherichia coli.Специфично може да ја деградира ДНК: РНК нишки во хибридни дуплекси на РНК, што резултира со олигонуклеотиди и мононуклеотиди со 3'-OH и 5'-монофосфатни краеви, не може да разградува едно- или двоверижна ДНК или РНК.

RNase

Функција и употреба

Рибонуклеазата може да ја катализира деградацијата на рибонуклеинската киселина (РНК) и може да се синтетизира вештачки.Медицинската маст се користи локално за лекување на траума и болки во зглобовите.Според извештаите, рибонуклеазата може да го промени метаболизмот на клетката домаќин, да ја инхибира синтезата на вирусот, да ја инхибира пролиферацијата на вирусот на инфлуенца ин витро и да го инхибира формирањето на вакцинија и вирусот на херпес кај пилешки ембриони.Клиничка употреба на рибонуклеаза дневна интрамускулна инјекција од 180 mg, корисна за третман на епидемиски енцефалитис, рибонуклеазата може да ја катализира деградацијата на рибонуклеинската киселина (РНК) и сега може вештачки да се синтетизира.Медицинската маст се користи локално за лекување на траума и болки во зглобовите.Според извештаите, рибонуклеазата може да го промени метаболизмот на клетката домаќин, да ја инхибира синтезата на вирусот, да ја инхибира пролиферацијата на вирусот на инфлуенца ин витро и да го инхибира формирањето на вакцинија и вирусот на херпес кај пилешки ембриони.Клиничката употреба на рибонуклеаза дневна интрамускулна инјекција од 180 mg е корисна за третман на епидемиски енцефалитис.

RNase

Дефиниција на инхибитор

Дефиниција на единицата за инхибитор на RNase: Количината на ензимот потребна за инхибирање на 50% од активноста на 5ng RNase A е една единица.

Како функционираат инхибиторите на RNase

Гванидин изотиоцијанат:

Гванидин изотиоцијанат е органско соединение со молекуларна формула C2H6N4S.Главно се користи во биолошката медицина, хемиските реагенси итн. Гванидин изотиоцијанат е средство за лизирање на протеини и често се користи како главна компонента на растворот за лиза во молекуларните дијагностички реагенси.Може да го лизира ткивото, да ја уништи клеточната структура и да ја дисоцира нуклеинската киселина од нуклеопротеинот и има силна денатурација во RNase.Тој е најефективниот инхибитор на RNase во моментов.

ТРИзол е нов реагенс за екстракција на тотална РНК кој може директно да ја извлече вкупната РНК од клетките или ткивата.Содржи супстанции како што се фенол и гванидин изотиоцијанат, кои можат брзо да ги нарушат клетките и да ги инхибираат нуклеазите ослободени од клетките.

(Сепак, гванидин изотиоцијанатот е опасен за здравјето на лабораториските истражувачи.)

RNasin:

Киселински гликопротеин извлечен од црн дроб на стаорец или човечки бластодерм.Rnasin е неконкурентен инхибитор на RNase, кој може да се врзе за различни RNase за да ги инактивира.

(Повеќе детали: https://www.foreivd.com/foreasy-rnase-inhibitor-product/)

Hвисока температура:

Високата температура е исто така вообичаено средство за денатурација на протеините.

Диетилпирокарбонат (DEPC):

DEPC е силен, но нецелосен инхибитор на RNase, кој може да ја инхибира активноста на RNase со комбинирање со аминокиселинскиот имидазолен прстен од активната група RNase за денатурација на протеините.

Ванадил рибонуклеозид комплекс:

Комплекс формиран од јони на ванадиум оксид и нуклеозиди, кои се врзуваат за RNase во форма на преодни супстанции, кои можат речиси целосно да ја инхибираат активноста на RNase

друго:

СДС, уреа, дијатомејска земја итн., исто така, имаат одредено инхибиторно дејство на RNase.

Експертски прегледи

Главниот техничар Ли Јуџи

Директор на Одделот за лабораторија, болницата Џиаожу, болницата Донгфанг, поврзана со Универзитетот Тонги

Со цел да се спречи биоразградување на егзогените RNase, маски, ракавици и капи треба да се носат и често да се заменуваат за време на процесот на екстракција на РНК.Сите стаклени садови мора да се печат во рерна за сушење на 200°C повеќе од 2 часа.Материјалите што се користат за печење, како што е пластиката, треба да се третираат со DEPC вода, а потоа да се мијат со дестилирана вода.Реагенсите или уредите што се користат за екстракција, зачувување и идентификација на РНК треба да бидат посветени на РНК и треба да се постави независна област за работа со РНК.

референци:

[1] Smith-Vaughan HC, Binks MJ, Beissbarth J, et al.Бактерии и вируси во назофаринксот непосредно пред почетокот на акутни инфекции на долните дишни патишта кај домородните австралиски деца [J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2018,37 (9): 1785-1794.

[2] Огранок за контрола на болнички инфекции на кинеската асоцијација за превентивна медицина.Насоки за собирање и инспекција на клинички микробиолошки примероци [J].Кинески весник за болничка инфекција, 2018 (20): 3192-3200.

[3] „Клинички тест Том на тест од десет илјади зошто молекуларна биологија“