Во раната фаза на избувнувањето, поради брзиот развој, брзата дијагноза на сомнителните пациенти е клучот за спречување на СОВИД-19.Некои одобрени реагенси за откривање на нуклеинска киселина имаат кратко време на развој и има проблеми како што се избрзана потврда на перформансите, недоволна оптимизација на реагенсот и големи разлики помеѓу сериите;Проблемите на различните клинички лаборатории во различни аспекти на процесот на откривање на нуклеинска киселина, исто така, може да влијаат на точноста на резултатите од откривањето на нуклеинската киселина.Оваа статија ќе се фокусира на клучните врски и точки во тековното откривање на нуклеинска киселина САРС-КоВ-2 и ќе ги анализира проблемите со лажно негативно и позитивно повторно испитување на лабораториското откривање на нуклеинска киселина и клиничката недоследност.

Принципи на откривање на нуклеинска киселина SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 е РНК вирус со геномска секвенца од околу 29 kb, со 10 гени, кои можат ефективно да кодираат 10 протеини.Вирусите се составени од РНК и протеини, а најоддалечениот слој е надворешна обвивка составена од липиди и гликопротеини.Внатре, протеинскиот капсид ја обвиткува РНК во него, а со тоа ја штити лесно разградливата РНК (Р1).

P1 Структура на SARS-COV-2

Вирусите ги напаѓаат клетките преку специфични рецептори на клеточната површина за да предизвикаат инфекција и ги користат клетките домаќини за да се реплицираат.

Принципот на откривање на вирусна нуклеинска киселина е да се изложи вирусната РНК преку клеточен лизат, а потоа да се користи флуоресцентна реверзна транскрипција-полимеразна верижна реакција (RT-PCR) во реално време за откривање.

Клучот за принципот на откривање е да се користат прајмери ​​и сонди за да се постигне „таргетирано совпаѓање“ на секвенците на нуклеинска киселина, односно да се најде низата на нуклеинска киселина на SARS-CoV-2 која е различна од другите вируси во околу 30.000 бази (сличноста на нуклеинската киселина со другите вируси) „Ниска“ област и сонди).

Прајмерите и сондите се многу усогласени со специфичниот регион на нуклеинската киселина SARS-CoV-2, односно специфичноста е многу силна.Откако резултатот од флуоресцентното засилување RT-PCR во реално време на примерокот што треба да се тестира е позитивен, тоа докажува дека SARS-CoV-2 е присутен во примерокот.Видете P2.

P2 Чекори на определување на нуклеинска киселина SARS-CoV-2 (флуоресцентна RT-PCR во реално време)

Услови и барања на лабораторија за откривање на нуклеинска киселина SARS-CoV-2

Лабораториите за тестирање на нуклеинска киселина се најидеални за средини со негативен притисок и тие треба да обрнат внимание на следењето на притисокот, да го одржуваат протокот на воздухот и да ги елиминираат аеросолите.Персоналот за тестирање на нуклеинска киселина мора да има соодветни квалификации, да добие соодветна обука за верижна реакција на полимераза и да ја помине проценката.Со лабораторијата треба строго да се управува, да се зонира на место, а ирелевантниот персонал е строго забранет да влегува.Чистата површина треба да се вентилира и да се дезинфицира на место.Релевантните предмети се поставуваат во зони, чистите и нечистите се одвојуваат, навреме се заменуваат и на место се деконтаминираат.Рутинска дезинфекција: Средството за дезинфекција што содржи хлор е главното решение за поголеми површини, а 75% алкохол може да се користи за мали површини.Добар начин да се справите со аеросолите е да ги отворите прозорците за вентилација, а дезинфекцијата на воздухот може да се изврши и со помош на ултравиолетови зраци, филтрација и дезинфекција на воздухот.

Клучни врски и параметри за определување на нуклеинска киселина SARS-CoV-2 (флуоресцентна RT-PCR во реално време)

Иако лабораториите генерално посветуваат големо внимание на „откривањето“ на нуклеинска киселина, всушност, „екстракцијата“ на нуклеинската киселина е исто така еден од клучните чекори за успешно откривање, што е тесно поврзано со собирањето и складирањето на примероци од вируси.

Во моментов, најкористените респираторни примероци, како што се назофарингеалните брисеви, го користат вториот метод, кој е раствор за инактивација (конзервација) подготвен врз основа на екстракција на нуклеинска киселина и раствор за лиза.Од една страна, ова решение за зачувување на вирусот може да го денатурира протеинот на вирусот, да ја изгуби својата активност и повеќе да не биде заразен и да ја подобри безбедноста на фазата на транспорт и откривање;од друга страна, може директно да го пробие вирусот за да ја ослободи нуклеинската киселина, да го елиминира ензимот за распаѓање на нуклеинската киселина и да го спречи вирусот.РНК се разградува.

Раствор за земање примероци од вирусот подготвен врз основа на раствор за лиза со екстракција на нуклеинска киселина.Главните компоненти се урамнотежени соли, хелатен агенс на етилендиамин тетраоцетна киселина, сол на гванидин (гванидин изотиоцијанат, гванидин хидрохлорид, итн.), анјонски сурфактант (додекан) натриум сулфат), катјонски сурфактант (тетрадецил триметил амониум, протеинолат, дилинеолокса). ase K и други неколку или повеќе компоненти.Во моментов, постојат многу видови комплети за екстракција на нуклеинска киселина и се користат различни реагенси за екстракција и прочистување на нуклеинска киселина.Дури и ако се користи истиот реагенс за екстракција и прочистување на нуклеинска киселина, процедурите за екстракција на секој комплет се различни.

Во моментов, производите од комплетот за откривање на нуклеинска киселина одобрени од Националната администрација за медицински производи се избрани врз основа на гените ORF1ab, E и N во геномот SARS-CoV-2.Принципите за откривање на различни производи се во основа исти, но нивните прајмери ​​и дизајни на сонди се различни.Постојат сегменти со една цел (ORF1ab), сегменти со двојна цел (ORF1ab, N или E) и сегменти со три цели (ORF1ab, N и E).Разликата помеѓу детекцијата и интерпретацијата, екстракцијата на нуклеинска киселина и системот за реакција на флуоресцентни RT-PCR во реално време треба да се однесува на соодветните упатства за комплетот и се препорачува корисниците строго да го следат методот на толкување наведен во упатствата за интерпретација на комплетот.Заедничките региони, прајмери ​​и секвенци на сонда засилени со флуоресцентен RT-PCR во реално време се прикажани во P3.

P3 Локацијата на целта на засилувачот SARS-CoV-2 на геномот и секвенцата на прајмери ​​и сонди

Толкување на резултатите од определувањето на нуклеинската киселина на SARS-CoV-2 (Rеал-Time флуоресцентна RT-PCR)

„Планот за превенција и контрола на пневмонија за инфекција со САРС-КоВ-2 (второ издание)“ за прв пат ги разјасни критериумите за оценување на резултатите од засилување на еден ген:

1. Нема Ct или Ct≥40 е негативен;

2. Ct<37 е позитивен;

3. Вредноста Ct од 37-40 е областа со сива скала.Се препорачува да се повтори експериментот.Ако резултатот од повторување на Ct<40 и кривата на засилување има очигледни врвови, примерокот се оценува како позитивен, во спротивно е негативен.

Третото издание на водичот и четвртото издание на водичот ги продолжија горенаведените критериуми.Меѓутоа, поради различните цели што се користат во комерцијалните комплети, гореспоменатото трето издание на водичот не ги даде критериумите за одредување на комбинацијата на цели, нагласувајќи дека ќе преовладуваат упатствата дадени од производителот.Почнувајќи од петтото издание на упатствата, разјаснети се две цели, особено критериумите за расудување за една цел што е тешко да се процени.Односно, ако лабораторијата сака да потврди дека случајот е позитивен за детекција на нуклеинска киселина SARS-CoV-2, потребно е да се исполнат 1 од 2 услови:

(1) Две цели на SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) во истиот примерок се тестирани позитивни со флуоресцентен RT-PCR во реално време.Ако една цел е позитивна, потребно е повторно земање примероци и повторно тестирање.Ако резултатите од тестот се Ако единствената цел е сè уште позитивна, таа се оценува како позитивна.

(2) Два примероци на флуоресцентни RT-PCR во реално време покажаа една цел позитивно во исто време или два примероци од ист тип покажаа единствена цел позитивен резултат од тестот, кој може да се оцени како позитивен.Сепак, упатствата исто така нагласуваат дека негативните резултати од тестирањето на нуклеинската киселина не можат да ја исклучат инфекцијата со САРС-КоВ-2.Треба да се исклучат факторите кои можат да предизвикаат лажни негативи, вклучувајќи слаб квалитет на примерокот (респираторни примероци од орофаринксот и други делови), собирање примероци прерано или предоцна, примероците не беа складирани, транспортирани и обработени правилно, а самата технологија имаше проблеми (варијација на вирусот, инхибиција на PCR) итн.

Причини за лажни негативи во откривањето на САРС-КоВ-2

Концептот на „лажно негативно“ во тестирањето на нуклеинска киселина што е моментално засегнат, често се однесува на „лажни негативни“ во кои резултатите од тестот за нуклеинска киселина не се во согласност со клиничките манифестации, односно клиничките симптоми и резултатите од сликите се многу сомнителни за СОВИД-19, но тестовите за нуклеинска киселина се секогаш „негативни“ многу пати.Клиничкиот лабораториски центар на Националната здравствена комисија го објасни „лажно негативниот“ тест за САРС-КоВ-2.

(1) Во клетките на заразеното лице има одредена количина на вирус.Постојните податоци покажуваат дека откако телото ќе се зарази со вирусот, вирусот навлегува во грлото преку носот и устата, потоа во душникот и бронхиите, а потоа стигнува до алвеолите.Инфицираното лице ќе го доживее периодот на инкубација, благи симптоми, а потоа процес на тешки симптоми и различни фази на болеста.И количината на вирусот присутен во различни делови од телото е различна.

Во однос на вирусното оптоварување на типовите на клетките, алвеоларните епителни клетки (долниот респираторен тракт)> епителните клетки на дишните патишта (горниот респираторен тракт)> фибробластите, ендотелните клетки и макрофагите итн.;од типот на примерокот, течност за алвеоларна лаважа (најодлична)>плунка за длабоко кашлање>назофарингеален брис>орофарингеален брис>крв.Покрај тоа, вирусот може да се открие и во измет.Меѓутоа, со оглед на практичноста на операцијата и прифаќањето на пациентите, најчесто користениот клинички примерок е орофарингеален брис> назофарингеален брис> течност за бронхијална лаважа (комплексна операција) и длабок спутум (обично сува кашлица, тешко се добива) .

Затоа, количината на вирус во клетките на орофаринксот или назофаринксот кај некои пациенти е мала или исклучително мала.Ако се земат само примероци од орофаринксот или назофаринксот за тестирање, вирусната нуклеинска киселина нема да биде откриена.

(2) За време на собирањето примероци не беа собрани клетки што содржат вирус или вирусната нуклеинска киселина не беше ефективно зачувана.

[① Неправилно место за собирање, на пример, кога се собираат орофарингеални брисеви, длабочината на собирање не е доволна, собраните назофарингеални брисеви не се собираат длабоко во носната шуплина итн. Повеќето од собраните клетки може да се клетки без вируси;

②Брисевите за земање примероци се користат неправилно.На пример, синтетички влакна како PE влакна, полиестерски влакна и полипропиленски влакна се препорачуваат за материјалот на главата на брис.Природните влакна како памукот се користат во реалната работа (силна адсорпција на протеини и не е лесно да се мијат) и најлонски влакна (лоша апсорпција на вода, што доведува до недоволен волумен на земање мостри);

③Неправилна употреба на цевки за складирање на вируси, како што е злоупотреба на полипропиленски или полиетиленски пластични цевки за складирање кои лесно се апсорбираат нуклеинските киселини (ДНК/РНК), што резултира со намалување на концентрацијата на нуклеинската киселина во растворот за складирање.Во пракса, се препорачува да се користи полиетилен-пропиленска полимерна пластика и некои специјално обработени полипропиленски пластични садови за складирање на вирусни нуклеински киселини.]

[① Неправилно место за собирање, на пример, кога се собираат орофарингеални брисеви, длабочината на собирање не е доволна, собраните назофарингеални брисеви не се собираат длабоко во носната шуплина итн. Повеќето од собраните клетки може да се клетки без вируси;

②Брисевите за земање примероци се користат неправилно.На пример, синтетички влакна како PE влакна, полиестерски влакна и полипропиленски влакна се препорачуваат за материјалот на главата на брис.Природните влакна како памукот се користат во реалната работа (силна адсорпција на протеини и не е лесно да се мијат) и најлонски влакна (лоша апсорпција на вода, што доведува до недоволен волумен на земање мостри);

③Неправилна употреба на цевки за складирање на вируси, како што е злоупотреба на полипропиленски или полиетиленски пластични цевки за складирање кои лесно се апсорбираат нуклеинските киселини (ДНК/РНК), што резултира со намалување на концентрацијата на нуклеинската киселина во растворот за складирање.Во пракса, се препорачува да се користи полиетилен-пропиленска полимерна пластика и некои специјално обработени полипропиленски пластични садови за складирање на вирусни нуклеински киселини.]

(4) Клиничката лабораториска работа не е стандардизирана.Условите за транспорт и складирање на примероците, стандардизираното работење на клиничките лаборатории, толкувањето на резултатите и контролата на квалитетот се клучните фактори за да се обезбеди точност и веродостојност на резултатите од тестот.Според резултатите од надворешната евалуација на квалитетот спроведена од Клиничкиот лабораториски центар на Националната здравствена комисија на 16-24 март 2020 година, од 844 лаборатории кои добиле валидни резултати, 701 (83,1%) биле квалификувани, а 143 (16,9%) не биле квалификувани.Квалификувани, севкупните услови за лабораториско тестирање се добри, но различни лаборатории сè уште имаат разлики во способноста за работа на персоналот, способноста за толкување на примерокот за позитивен примерок за една цел и контрола на квалитетот.

Како да се намали лажно негативното откривање на нуклеинска киселина САРС-КоВ-2?

Намалувањето на лажните негативи во откривањето на нуклеинската киселина треба да се оптимизира од четирите аспекти на производство на лажни негативни.

(1) Во клетките на заразеното лице има одредена количина на вирус.Концентрацијата на вирусот во различни делови од телото на сомнителните заразени лица ќе биде различна во различни периоди.Ако нема фаринкс, тој може да биде во течност за бронхијална лаважа или измет.Ако може да се соберат повеќе типови примероци во исто време или во различни фази на прогресија на болеста за тестирање, ќе помогне да се избегнат лажни негативни резултати.

(2) За време на собирањето примероци треба да се собираат клетки кои содржат вирус.Овој проблем може да се реши во голема мера со зајакнување на обуката на собирачите на примероци.

(3) Сигурни IVD реагенси.Со спроведување на истражување за евалуација на перформансите на детекција на реагенси на национално ниво и дискусија за постоечките проблеми, ефикасноста на откривање на реагенсите може дополнително да се подобри и чувствителноста на анализата може да се подобри.

(4) Стандардизирано работење на клиничките лаборатории.Со зајакнување на обуката на лабораторискиот персонал, континуирано подобрување на системот за управување со квалитетот на лабораторијата, обезбедување разумни поделби и подобрување на способноста на персоналот за откривање, можно е да се намалат лажните негативи поради несоодветни лабораториски операции.

Причини за повторен позитивен тест на SARS-CoV-2 тест на нуклеинска киселина кај закрепнати и отпуштени пациенти

„Планот за дијагностицирање и третман на COVID-19 (испитување на седмото издание)“ јасно предвидува дека еден од критериумите за пациенти со ковид-19 да се излечат и испуштаат од болницата е дека два последователни примероци на респираторниот тракт имаат негативен тест за нуклеинска киселина (најмалку 24 часа одвоени), но има многу малку одвоени од САРС-ЦОВ-2, повторно се однесуваше на разни причини.

(1)SARS-CoV-2 е нов вирус.Неопходно е дополнително да се разбере неговиот патоген механизам, целосната слика за предизвиканата болест и карактеристиките на текот на болеста.Затоа, од една страна, неопходно е да се зајакне управувањето со отпуштените пациенти и да се спроведе 14-дневно медицинско набљудување.Спроведување на следење, следење на здравјето и здравствени насоки за да се продлабочи разбирањето на целиот процес на појава, развој и исход на болеста.

(2) Пациентот може повторно да биде заразен со вирусот.Академик Жонг Наншан рече: Бидејќи излечените пациенти имаат антитела, САРС-КоВ-2 може да се елиминира со антитела кога тие повторно ќе нападнат.Постојат многу причини, кои може да бидат причина за опоравениот пациент, или може да се поврзани со мутација на вирусот, па дури и причина за лабораториско тестирање.Ако се работи за самиот вирус, мутацијата на САРС-КоВ-2 може да предизвика антителата произведени од опоравениот пациент да бидат неефикасни против мутираниот вирус.Ако пациентот е повторно заразен со мутираниот вирус, тестот за нуклеинска киселина може повторно да биде позитивен.

(3) Што се однесува до лабораториските методи за тестирање, секој метод на тестирање има свои ограничувања.Откривањето на нуклеинската киселина на SARS-CoV-2 се должи на изборот на генската секвенца, составот на реагенсите, чувствителноста на методот и други причини, што доведува до тоа дека постоечките комплети имаат свои пониски граници за откривање.Откако ќе се лекува пациентот, вирусот во телото се намалува.Кога вирусното оптоварување во примерокот што треба да се тестира е под долната граница на откривање, ќе се појави „негативен“ резултат.Сепак, овој резултат не значи дека вирусот во телото целосно исчезнал.Вирусот може да биде по прекин на третманот.Resurgence“, продолжи со копирање.Затоа, се препорачува преглед еднаш неделно во рок од 2 до 4 недели по испуштањето.

(4) Нуклеинската киселина е генетскиот материјал на вирусот.Вирусот е убиен откако пациентот е подложен на антивирусно лекување, но преостанатите фрагменти од вирусна РНК сè уште се задржуваат во човечкото тело и не се целосно испуштени од телото.Понекогаш, под одредени околности, може повеќе да се задржи.Долго време и во тоа време тестот за нуклеинска киселина ќе биде „минлив“ позитивен.Со продолжување на времето за опоравување на пациентот, откако резидуалните фрагменти на РНК во телото постепено ќе се исцрпат, резултатот од тестот за нуклеинска киселина може да стане негативен.

(5) Резултатот од тестот на нуклеинската киселина на САРС-КоВ-2 само го докажува присуството или отсуството на вирусна РНК и не може да ја докаже активноста на вирусот и дали вирусот е пренослив.Неопходно е да се докаже дали пациентот кој повторно има позитивен тест за нуклеинска киселина ќе стане повторно извор на инфекција.Неопходно е да се изврши култура на вирус на клинички примероци и да се одгледува „жив“ вирус за да се докаже дека е заразен.

Резиме

Накратко, лажно негативните тестови на нуклеинската киселина на SARS-CoV-2, позитивните повторени тестови и другите состојби кои не се во согласност со клиничките манифестации не можат целосно да се избегнат.При вистинскиот скрининг и тестирање, се препорачува да се комбинираат клиничките симптоми, имиџинг прегледите (КТ) и експериментите Резултатите од лабораториските тестови (тест на нуклеинска киселина + тест за специфични антитела за вирусот) за сеопфатна дијагноза за да се спречи пропуштена дијагноза и погрешна дијагноза.Доколку се открие дека резултатите од тестот се очигледно неконзистентни со клиничките манифестации, се препорачува да се спроведе сеопфатна анализа на целата врска од тестот (врски за собирање примероци, циркулација и обработка) за да се исклучи раната инфекција со вирусот САРС-КоВ-2, рекурентна инфекција или комбинирана со други можни респираторни вирусни инфекции итн.Доколку условите дозволуваат, се препорачува да се соберат почувствителни примероци како што се спутум или течност за алвеоларна лаважа за повторно испитување.

Поврзани производи:

Комплет за откривање нуклеинска киселина SARS-CoV-2 (Метод на флуоресцентна сонда со мултиплекс PCR)