• PCR е метод кој се користи за засилување на ДНК од мала количина на ДНК шаблон.RT-PCR користи обратна транскрипција за да произведе образец на ДНК од извор на РНК кој потоа може да се засили.
• PCR и RT-PCR се типично реакции на крајната точка, додека qPCR и RT-qPCR ја користат кинетиката на брзината на синтеза на производот за време на PCR реакцијата за да ја квантифицираат количината на присутен шаблон.
• Поновите методи, како што е дигиталната PCR, обезбедуваат апсолутна квантитација на почетната шаблон за ДНК, додека методите како што е изотермалниот PCR ја намалуваат потребата за скапа опрема за да се обезбедат сигурни резултати.

Полимеразна верижна реакција (PCR) е релативно едноставна и широко користена техника на молекуларна биологија за засилување и откривање на секвенци на ДНК и РНК.Во споредба со традиционалните методи на клонирање и засилување на ДНК, што често може да трае со денови, за PCR потребни се само неколку часа.PCR е многу чувствителен и бара минимален шаблон за детекција и засилување на специфични секвенци.Основните методи на PCR дополнително напреднаа од едноставна детекција на ДНК и РНК.Подолу, дадовме преглед на различните методи на PCR и реагенсите што ги обезбедуваме во Enzo Life Sciences за вашите потреби за истражување.Наша цел е да им помогнеме на научниците брзо да пристапат до PCR реагенси за да ги користат во нивниот следен истражувачки проект!

PCR

За стандардна PCR, сè што ви треба е ДНК полимераза, магнезиум, нуклеотиди, прајмери, шаблонот за ДНК што треба да се засилува и термоциклерот.Механизмот на PCR е исто толку едноставен како и неговата цел: 1) двоверижна ДНК (dsDNA) е топлина денатурирана, 2) прајмери ​​се усогласуваат со единечните ДНК нишки и 3) прајмерите се прошируваат со ДНК полимераза, што резултира со две копии од оригинална нишка на ДНК.Процесот на денатурација, жарење и издолжување во текот на низа температури и времиња е познат како еден циклус на засилување (сл. 1).

Секој чекор од циклусот треба да се оптимизира за користениот шаблон и сет на прајмери.Овој циклус се повторува приближно 20-40 пати, а засилениот производ потоа може да се анализира, обично со агарозен гел (сл. 2).

Бидејќи PCR е многу чувствителен метод и потребни се многу мали волумени за единечни реакции, се препорачува подготовка на мастер микс за неколку реакции.Главниот микс мора добро да се измеша, а потоа да се подели по бројот на реакции, осигурувајќи дека секоја реакција ќе содржи иста количина на ензими, dNTP и прајмери.Многу добавувачи, како што е Enzo Life Sciences, исто така нудат PCR мешавини кои веќе содржат сè освен прајмери ​​и шаблонот за ДНК.

Регионите богати со гванин/цитозин (богати со GC) претставуваат предизвик во стандардните PCR техники.Секвенците богати со GC се постабилни од секвенците со помала содржина на GC.Понатаму, секвенците богати со GC имаат тенденција да формираат секундарни структури, како што се петелките за фиба.Како резултат на тоа, двојните жици богати со GC тешко се целосно одвојуваат за време на фазата на денатурација.Следствено, ДНК полимеразата не може без пречки да ја синтетизира новата нишка.Повисоката температура на денатурација може да го подобри ова, а прилагодувањата кон повисока температура на жарење и пократко време на жарење може да го спречат неспецифичното врзување на прајмерите богати со GC.Дополнителни реагенси може да го подобрат засилувањето на секвенците богати со GC.DMSO, глицеролот и бетаинот помагаат да се нарушат секундарните структури кои се предизвикани од интеракциите на GC и со тоа го олеснуваат одвојувањето на двојните нишки.

Hot Start PCR

Неспецифичното засилување е проблем што може да се појави за време на PCR.Повеќето ДНК полимерази кои се користат за PCR најдобро функционираат на температури од околу 68°C до 72°C.Меѓутоа, ензимот може да биде активен и на пониски температури, иако во понизок степен.На температури далеку под температурата на жарење, прајмерите можат неспецифично да се врзат и да доведат до неспецифично засилување, дури и ако реакцијата е поставена на мраз.Ова може да се спречи со користење на инхибитори на полимераза кои се дисоцираат од ДНК полимеразата само штом ќе се достигне одредена температура, па оттука и терминот PCR со топол почеток.Инхибиторот може да биде антитело кое ја врзува полимеразата и денатурира на почетната температура на денатурација (обично 95°C).

Полимераза со висока верност

Додека ДНК полимеразите прилично прецизно се засилуваат до оригиналната шаблонска секвенца, може да се појават грешки во совпаѓањето на нуклеотидите.Неусогласеноста во апликациите како што е клонирањето може да резултира со скратени транскрипти и погрешно преведени или неактивни протеини низводно.За да се избегнат овие несовпаѓања, полимеразите со активност на „лекторирање“ се идентификувани и инкорпорирани во работниот тек.Првата полимераза за лекторирање, Pfu, беше идентификувана во 1991 година во Pyrococcus furiosus.Овој Pfu ензим има 3' до 5' егзонуклеазна активност.Како што ДНК се засилува, егзонуклеазата ги отстранува неусогласените нуклеотиди на 3'-крајот на жицата.Точниот нуклеотид потоа се заменува, а синтезата на ДНК продолжува.Идентификацијата на неточни нуклеотидни секвенци се заснова на врзувачкиот афинитет за правилниот нуклеозид трифосфат со ензимот, каде што неефикасното врзување ја забавува синтезата и овозможува правилна замена.Лекторската активност на Pfu полимеразата резултира со помалку грешки во конечната секвенца во споредба со Taq DNA полимеразата.Во последниве години, идентификувани се други ензими за лекторирање и направени се модификации на оригиналниот ензим Pfu за дополнително да се намали стапката на грешка при засилување на ДНК.

RT-PCR

Обратна транскрипција PCR, или RT-PCR, дозволува употреба на РНК како шаблон.Дополнителен чекор овозможува откривање и засилување на РНК.РНК е обратно транскрибирана во комплементарна ДНК (cDNA), користејќи реверзна транскриптаза.Квалитетот и чистотата на шаблонот за РНК се од суштинско значење за успехот на RT-PCR.Првиот чекор на RT-PCR е синтеза на хибрид на ДНК/РНК.Обратна транскриптаза, исто така, има функција на RNase H, која го разградува РНК делот од хибридот.Едноверижната ДНК молекула потоа се комплетира со активноста на ДНК полимеразата зависна од ДНК на реверзната транскриптаза во cDNA.Ефикасноста на реакцијата на првата жица може да влијае на процесот на засилување.Оттука натаму, стандардната PCR процедура се користи за засилување на cDNA.Можноста да се врати РНК во cDNA со RT-PCR има многу предности и првенствено се користи за анализа на генската експресија.РНК е едноверижна и многу нестабилна, што ја прави предизвик да се работи со неа.Најчесто служи како прв чекор во qPCR, кој ги квантифицира транскриптите на РНК во биолошки примерок.

qPCR и RT-qPCR

Квантитативниот PCR (qPCR) се користи за откривање, карактеризирање и квантифицирање на нуклеинските киселини за бројни апликации.Во RT-qPCR, транскриптите на РНК често се квантифицираат со обратна транскрипција на нив во cDNA прво, како што е опишано погоре, а потоа последователно се спроведува qPCR.Како и кај стандардниот PCR, ДНК се засилува со три чекори кои се повторуваат: денатурација, жарење и издолжување.Меѓутоа, во qPCR, флуоресцентното означување овозможува собирање на податоци како што напредува PCR.Оваа техника има многу предности поради опсегот на достапни методи и хемии.

Во qPCR базирана на боја (обично зелена), флуоресцентното означување овозможува квантификација на засилените молекули на ДНК со употреба на боја за врзување dsDNA.За време на секој циклус се мери флуоресценцијата.Флуоресцентниот сигнал се зголемува пропорционално на количината на реплицирана ДНК.Оттука, ДНК се квантифицира во „реално време“ (сл. 3).Недостатоците на qPCR базирани на боја се тоа што може да се испита само една цел во исто време и дека бојата ќе се врзе за која било ds-DNA присутна во примерокот.

Во qPCR заснована на сонда, многу цели може да се откријат истовремено во секој примерок, но ова бара оптимизација и дизајн на сонда(и) специфична за целта што се користи како додаток на прајмери.Достапни се неколку типови дизајни на сонди, но најчестиот тип е сонда за хидролиза, која вклучува флуорофор и гаснење.Трансфер на енергија со флуоресцентна резонанца (FRET) ја спречува емисијата на флуорофорот преку гаснечот додека сондата е недопрена.Меѓутоа, за време на PCR реакцијата, сондата се хидролизира за време на продолжување на прајмерот и засилување на специфичната низа за која е врзана.Расцепувањето на сондата го одвојува флуорофорот од гаснечот и резултира со зголемување на флуоресценцијата зависно од засилување (сл. 4).Така, флуоресцентниот сигнал од реакцијата qPCR базирана на сонда е пропорционална на количината на целната секвенца на сондата присутна во примерокот.Бидејќи qPCR базиран на сонда е поспецифичен од qPCR базиран на боја, таа често е технологија што се користи во дијагностички анализи базирани на qPCR.

Изотермално засилување

Техниките за PCR споменати погоре бара скапа опрема за термоциклирање за прецизно зголемување и намалување на температурите во комората за чекорите на денатурација, жарење и продолжување.Развиени се голем број техники на кои не им се потребни толку прецизни уреди и може да се изведат во едноставна водена бања или дури и во ќелиите од интерес.Овие техники колективно се нарекуваат изотермално засилување и работат врз основа на експоненцијално, линеарно или каскадно засилување.

Најпознатиот тип на изотермално засилување е изотермалното засилување со посредство на јамка или LAMP.LAMP користи експоненцијално засилување на 65⁰C за засилување на шаблонот ДНК или РНК.При изведување на LAMP, четири до шест прајмери ​​комплементарни на регионите на целната ДНК се користат со ДНК полимераза за да се синтетизира нова ДНК.Два од овие прајмери ​​имаат комплементарни секвенци кои препознаваат секвенци во другите прајмери ​​и ги врзуваат, овозможувајќи да се формира структура на „јамка“ во новосинтетизираната ДНК што потоа помага при кинење на прајмерот во следните рунди на засилување.LAMP може да се визуелизира со повеќе методи, вклучувајќи флуоресценција, електрофореза со гел агароза или колориметрија.Леснотијата на визуелизирање и откривање на присуството или отсуството на производот со колориметрија и недостатокот на потребна скапа опрема го направија LAMP соодветна опција за тестирање SARS-CoV-2 во области каде што клиничкото лабораториско тестирање не беше лесно достапно, или складирање и транспорт на примероци не беше изводливо или во лаборатории кои претходно немаа PCR опрема за термоциклирање.