1. Основно знаење (ако сакате да го видите експерименталниот дел, префрлете директно на вториот дел)
Како деривативна реакција на конвенционалната PCR, Real time PCR главно ја следи промената на количината на производот за засилување во секој циклус на PCR реакцијата на засилување во реално време преку промената на флуоресцентниот сигнал и квантитативно го анализира почетниот шаблон преку односот помеѓу вредноста на ct и стандардната крива.
Специфичните податоци на RT-PCR сеосновната линија, праг на флуоресценцијаиCt вредност.
| основна линија: | Флуоресцентната вредност на 3-15 циклус е основната линија (основна линија), која е предизвикана од повремената грешка на мерењето. |
| Праг (праг): | Се однесува на границата за детекција на флуоресценција поставена на соодветна позиција во регионот на експоненцијален раст на кривата на засилување, генерално 10 пати повеќе од стандардното отстапување на основната линија. |
| КТ вредност: | Тоа е бројот на циклуси на PCR кога вредноста на флуоресценцијата во секоја реакциона цевка го достигнува прагот. Вредноста Ct е обратно пропорционална со количината на почетниот шаблон. |
Вообичаени методи за означување за RT-PCR:
| метод | предност | недостаток | опсег на примена |
| SYBR GreenⅠ | Широка применливост, чувствителна, евтина и удобна | Барањата за прајмер се високи, склони кон неспецифични ленти | Погоден е за квантитативна анализа на различни целни гени, истражување на генска експресија и истражување на трансгенски рекомбинантни животни и растенија. |
| TaqMan | Добра специфичност и висока повторливост | Цената е висока и погодна само за специфични цели. | Откривање на патоген, истражување на гени за отпорност на лекови, проценка на ефикасноста на лекот, дијагноза на генетски болести. |
| молекуларен светилник | Висока специфичност, флуоресценција, ниска позадина | Цената е висока, погодна е само за одредена намена, дизајнот е тежок, а цената е висока. | Специфична генска анализа, SNP анализа |
2. Експериментални чекори
2.1 За експерименталното групирање- мора да има повеќе бунари во групата, и мора да има биолошки повторувања.
| ① | Празно контрола | Се користи за откривање на статусот на раст на клетките во експериментите |
| ② | Негативна контрола siRNA (неспецифична siRNA секвенца) | Покажете ја специфичноста на дејството на RNAi.siRNA може да предизвика неспецифичен одговор на стрес во концентрација од 200nM. |
| ③ | Контрола на реагенс за трансфекција | Исклучете ја токсичноста на реагенсот за трансфекција на клетките или ефектот врз експресијата на целниот ген |
| ④ | siRNA против целниот ген | Соборете го изразот на целниот ген |
| ⑤ (изборно) | позитивна siRNA | Се користи за решавање проблеми на експерименталниот систем и оперативните проблеми |
| ⑥ (изборно) | Флуоресцентна контрола siRNA | Ефикасноста на клеточната трансфекција може да се набљудува со микроскоп |
2.2 Принципи на дизајн на прајмер
| Засилена големина на фрагмент | По можност на 100-150bp |
| Должина на буквар | 18-25bp |
| Содржина на GC | 30%-70%, по можност 45%-55% |
| Tm вредност | 58-60 ℃ |
| Секвенца | Избегнувајте T/C континуирано;A/G континуирано |
| 3 крајна низа | Избегнувајте богат со GC или AT богат;терминалната основа е по можност G или C;најдобро е да се избегнува Т |
| Комплементарност | Избегнувајте комплементарни секвенци од повеќе од 3 бази во рамките на прајмерот или помеѓу два прајмери |
| Специфичност | Користете експлозивно пребарување за да ја потврдите специфичноста на прајмерот |
①SiRNA е специфична за видовите, а низите на различни видови ќе бидат различни.
②SiRNA е спакувана во замрзнато сушен прашок, кој може да се чува стабилно 2-4 недели на собна температура.
2.3 Алатки или реагенси кои треба да се подготват однапред
| Прајмер (внатрешна референца) | Вклучувајќи две напред и назад |
| Прајмери (целен ген) | Вклучувајќи две напред и назад |
| Целна Si РНК (3 ленти) | Општо земено, компанијата ќе синтетизира 3 ленти, а потоа ќе избере една од трите со RT-PCR |
| Комплет за трансфекција | Lipo2000 итн. |
| Комплет за брза екстракција на РНК | За екстракција на РНК по трансфекција |
| Комплет за брза обратна транскрипција | за синтеза на cDNA |
| Комплет за засилување на PCR | 2×Супер SYBR зелено qPCR Master Mix |
2.4 Во однос на прашањата на кои треба да се обрне внимание во конкретните експериментални чекори:
① siRNA трансфекција процес
1. За позлата, можете да изберете плоча со 24 бунари, плоча со 12 бунари или плоча со 6 бунари (просечната концентрација на РНК предложена во секој бунар од плоча со 24 бунари е околу 100-300 ng/uL), а оптималната густина на трансфекција на клетките е до 60%-80% или така
2. Чекорите на трансфекција и специфичните барања се строго во согласност со упатствата.
3. По трансфекцијата, примероците може да се соберат во рок од 24-72 часа за откривање на mRNA (RT-PCR) или откривање на протеини во рок од 48-96 часа (WB)
② РНК екстракција процес
1. Спречете ја контаминацијата со егзогени ензими.Тоа главно вклучува строго носење маски и ракавици;користење на стерилизирани врвови за пипети и ЕП цевки;водата што се користи во експериментот мора да биде без RNase.
2. Се препорачува да се направи двапати како што е предложено во комплетот за брза екстракција, што навистина ќе ја подобри чистотата и приносот.
3. Отпадната течност не смее да ја допира РНК колоната.
③ квантификација на РНК
Откако ќе се извлече РНК, таа може да се квантифицира директно со Nanodrop, а минималното отчитување може да биде дури 10ng/ul.
④Процес на обратна транскрипција
1. Поради високата чувствителност на RT-qPCR, треба да се направат најмалку 3 паралелни бунари за секој примерок за да се спречи последователниот Ct да биде премногу различен или SD да биде преголем за статистичка анализа.
2. Не замрзнувајте и одмрзнувајте Master mix повеќепати.
3. Секоја цевка/дупка мора да се замени со нов врв!Не користете постојано ист врв на пипета за додавање примероци!
4. Филмот прикачен на плочата со 96 бунари по додавањето на примерокот треба да се измазне со чинија.Најдобро е да се центрифугира пред да се стави на машината, за да може течноста на ѕидот на цевката да тече надолу и да ги отстрани воздушните меури.
⑤Заедничка анализа на кривата
| Нема период на логаритамски раст | Можно е висока концентрација на шаблон |
| Нема вредност на КТ | Неточни чекори за откривање флуоресцентни сигнали; деградација на прајмери или сонди - неговиот интегритет може да се открие со PAGE електрофореза; недоволна количина на шаблон; деградација на шаблоните – избегнување на внесување нечистотии и повеќекратно замрзнување и одмрзнување при подготовката на примерокот; |
| Ct>38 | Ниска ефикасност на засилување;PCR производот е премногу долг;различни компоненти на реакцијата се разградуваат |
| Линеарна крива на засилување | Сондите може делумно да се разградат со повторени циклуси на замрзнување-одмрзнување или продолжено изложување на светлина |
| Разликата во дупликатните дупки е особено голема | Реакциониот раствор не е целосно стопен или растворот за реакција не е измешан;термалната бања на PCR инструментот е контаминирана со флуоресцентни супстанции |
2.5 За анализа на податоци
Анализата на податоците на qPCR може да се подели на релативна квантификација и апсолутна квантификација.На пример, клетките во групата за третман во споредба со клетките во контролната група,
Колку пати се менува mRNA на генот X, ова е релативна квантификација;во одреден број клетки, mRNA на генот X
Колку копии има, ова е апсолутна квантификација.Обично она што најмногу го користиме во лабораторија е релативната квантитативна метода.Обично,методот 2-ΔΔctнајмногу се користи во експериментите, така што само овој метод ќе биде детално воведен овде.
Метода 2-ΔΔct: Добиениот резултат е разликата во изразувањето на целниот ген во експерименталната група во однос на целниот ген во контролната група.Потребно е ефикасноста на засилување и на целниот ген и на внатрешниот референтен ген да се блиску до 100%, а релативното отстапување не треба да надминува 5%.
Методот на пресметка е како што следува:
Δct контролна група = ct вредност на целниот ген во контролната група – ct вредност на внатрешен референтен ген во контролната група
Δct експериментална група = ct вредност на целниот ген во експерименталната група – ct вредност на внатрешниот референтен ген во експерименталната група
ΔΔct=Δct експериментална група-Δct контролна група
Конечно, пресметајте го множителот на разликата во нивото на изразување:
Промени Fold=2-ΔΔct (што одговара на ексел функцијата е POWER)
Поврзани производи:
Време на објавување: мај-20-2023 година
