一, Зголемете ја чувствителноста на системот за реакција:

1. Изолирајте висококвалитетна РНК:

Успешната синтеза на cDNA доаѓа од висококвалитетна РНК.Висококвалитетната РНК треба барем да биде целосна и без инхибитори на реверзна транскриптаза како што се EDTA или SDS.Квалитетот на РНК го одредува максималниот износ на информации за низата што можете да ги транскрибирате во cDNA.Вообичаен метод за прочистување на РНК е метод во еден чекор кој користи гванидин изотиоцијанат/киселински фенол.За да се спречи контаминација со траги од RNase, РНК изолирана од примероци богати со RNase (како панкреасот) треба да се складира во формалдехид за да се зачува висококвалитетната РНК, особено за долгорочно складирање.РНК извлечена од црниот дроб на стаорец во основа се разградува откако се чуваше во вода една недела, додека РНК извлечена од слезината на стаорец остана стабилна откако беше складирана во вода 3 години.Дополнително, транскриптите подолги од 4 kb се почувствителни на деградација со RN-ази во трагови отколку малите транскрипти.За да се зголеми стабилноста на складираните примероци на РНК, РНК може да се раствори во дејонизиран формамид и да се чува на -70°C.Формамидот што се користи за зачувување на РНК мора да биде ослободен од остатоци што ја разградуваат РНК.РНК од панкреасот може да се чува во формамид најмалку една година.Кога се подготвувате да користите РНК, можете да го користите следниов метод за таложење на РНК: додадете NaCl до 0,2 M и 4 пати повеќе од волуменот на етанол, ставете на собна температура 3-5 минути и центрифугирајте на 10.000 × g 5 минути.

2. Користете ја реверзната транскриптаза која е неактивна RNaseH (RNaseH-):

Инхибиторите на RNase често се додаваат во реакциите на обратна транскрипција за да се зголеми должината и приносот на синтезата на cDNA.Инхибиторите на RNase треба да се додадат за време на реакцијата на синтеза на првата нишка во присуство на пуфер и редукционен агенс (како што е DTT), бидејќи процесот пред синтезата на cDNA го денатурира инхибиторот, со што се ослободува врзана RNase која може да ја разгради РНК.Инхибиторите на протеинската РНаза само го спречуваат разградувањето на РНК со РНаза А, Б, Ц и не ја спречуваат РНазата на кожата, затоа внимавајте да не внесувате РНаза од вашите прсти и покрај употребата на овие инхибитори.

Обратна транскриптаза ја катализира конверзијата на РНК во cDNA.И M-MLV и AMV имаат ендогена активност на RNaseH како додаток на нивната сопствена полимеразна активност.Активноста на RNaseH и активноста на полимеразата се натпреваруваат една со друга за хибридната влакно формирана помеѓу шаблонот на РНК и прајмерот на ДНК или продолжетокот на cDNA, и ја разградуваат нишката РНК во комплексот РНК:ДНК.Шаблонот на РНК деградиран од активноста на RNaseH повеќе не може да служи како ефективен супстрат за синтеза на cDNA, што го намалува приносот и должината на синтезата на cDNA.Затоа, би било корисно да се елиминира или значително да се намали активноста на RNaseH на реверзната транскриптаза.

SuperScript Ⅱ обратна транскриптаза, RNaseH-MMLV реверзна транскриптаза и thermoScript обратна транскриптаза, RNaseH- AMV, може да добијат повеќе количество и повеќе cDNA со целосна должина од MMLV и AMV.Сензитивноста на RT-PCR ќе биде под влијание на количината на синтеза на cDNA.ThermoScript е многу почувствителен од AMV.Големината на RT-PCR производите е ограничена од способноста на реверзната транскриптаза да синтетизира cDNA, особено кога се клонираат поголеми cDNA.Во споредба со MMLV, SuperScripⅡ значително го зголеми приносот на долгите RT-PCR производи.Реверзната транскриптаза RNaseH, исто така, има зголемена термостабилност, така што реакцијата може да се изведува на температури повисоки од нормалните 37-42°C.Под предложените услови за синтеза, користете oligo(dT) прајмер и 10 μCi од [α-P]dCTP.Вкупниот принос на првата нишка беше пресметан со користење на методот на таложење TCA.Целосната cDNA беше анализирана користејќи ленти подредени по големина, исечени и избројани на алкален агарозен гел.

3. Зголемете ја температурата на инкубација за обратна транскрипција:

Повисоката температура на инкубација помага да се отвори секундарната структура на РНК, зголемувајќи го приносот на реакцијата.За повеќето шаблони на РНК, инкубирањето на РНК и прајмерите на 65°C без пуфер или сол, проследено со брзо ладење на мраз ќе ги елиминира повеќето секундарни структури и ќе им овозможи на прајмерите да се врзат.Сепак, некои шаблони сè уште имаат секундарни структури, дури и по топлинска денатурација.Засилувањето на овие тешки шаблони може да се изврши со користење на ThermoScript Reverse Transcriptase и поставување на реакцијата на обратна транскрипција на повисока температура за да се подобри засилувањето.Повисоките температури на инкубација, исто така, може да ја зголемат специфичноста, особено кога се користат ген-специфични прајмери ​​(GSP) за синтеза на cDNA (види Поглавје 3).Ако користите GSP, проверете дали Tm на прајмерите е иста со очекуваната температура на инкубација.Не користете олиго(dT) и случајни прајмери ​​над 60°C.Случајните прајмери ​​бараат инкубација на 25°C 10 минути пред да се зголемат на 60°C.Покрај користењето на повисока температура на обратна транскрипција, специфичноста може да се подобри и со директно пренесување на мешавината на РНК/прајмер од температурата на денатурација од 65°C до температурата на инкубација на обратна транскрипција и додавање на претходно загреана 2× реакциона смеса (синтеза на вжештен почеток на cDNA) .Овој пристап помага да се спречи меѓумолекуларното спарување на базите што се случува на пониски температури.Повеќекратното температурно префрлување потребно за RT-PCR може да се поедностави со користење на термички циклус.

Tth термостабилна полимераза делува како ДНК полимераза во присуство на Mg2+ и како РНК полимераза во присуство на Mn2+.Може да се чува топло на максимална температура од 65°C.Сепак, присуството на Mn2+ за време на PCR ја намалува верноста, што ја прави Tth полимеразата помалку погодна за амплификација со висока прецизност, како што е клонирање на cDNA.Дополнително, Tth има ниска ефикасност на обратна транскрипција, што ја намалува чувствителноста, и бидејќи обратната транскрипција и PCR може да се изведат со еден ензим, контролните реакции без обратна транскрипција не може да се користат за да се споредат производите за засилување на cDNA со контаминирана геномска ДНК.Производите за засилување беа одвоени.

4. Адитиви кои промовираат обратна транскрипција:

Адитиви, вклучително и глицерол и DMSO, се додаваат во реакцијата на синтеза на првата нишка, што може да ја намали стабилноста на двојно-влакното на нуклеинската киселина и да ја одврзе секундарната структура на РНК.Може да се додаде до 20% глицерол или 10% DMSO без да влијае на активноста на SuperScript II или MMLV.АМВ исто така може да толерира до 20% глицерол без губење на активноста.Со цел да се зголеми чувствителноста на RT-PCR во реакцијата на обратна транскрипција SuperScriptⅡ, може да се додаде 10% глицерол и да се инкубира на 45°C.Ако 1/10 од производот на реакцијата на обратна транскрипција се додаде на PCR, тогаш концентрацијата на глицерол во реакцијата на засилување е 0,4%, што не е доволно за да се инхибира PCR.

5. Третман со RNaseH:

Третманот на реакциите на синтеза на cDNA со RNaseH пред PCR може да ја зголеми чувствителноста.За некои шаблони, се смета дека РНК во реакцијата на синтеза на cDNA го спречува врзувањето на производите за засилување, во кој случај третманот со RNaseH може да ја зголеми чувствителноста.Општо земено, третманот со RNaseH е неопходен кога се засилуваат подолгите целни шаблони на cDNA со целосна должина, како што е туберозна шероза II со ниска копија.За овој тежок шаблон, третманот со RNaseH го подобри сигналот произведен од SuperScript II или cDNA синтетизирана со AMV.За повеќето RT-PCR реакции, третманот со RNaseH е изборен, бидејќи чекорот на денатурација на PCR на 95°C генерално ја хидролизира РНК во комплексот РНК:ДНК.

6. Подобрување на методот за откривање на мала РНК:

RT-PCR е особено предизвикувачки кога се достапни само мали количини на РНК.Гликогенот додаден како носител за време на изолацијата на РНК помага да се зголеми приносот на мали примероци.Гликоген без RNase може да се додаде истовремено со додавање на Trizol.Гликогенот е растворлив во вода и може да се чува во водена фаза со РНК за да се помогне последователното таложење.За примероци помали од 50 mg ткиво или 106 култивирани клетки, препорачаната концентрација на гликоген без RNase е 250 μg/ml.

Додавањето ацетилирана BSA на реакцијата на обратна транскрипција со помош на SuperScript II може да ја зголеми чувствителноста, а за мали количини на РНК, намалувањето на количината на SuperScript II и додавањето 40 единици на нуклеаза инхибитор на RNaseOut може да го зголеми нивото на детекција.Доколку се користи гликоген во процесот на изолација на РНК, сепак се препорачува да се додаде BSA или RNase инхибитор кога се користи SuperScript II за реакција на обратна транскрипција.

二, Зголемете ја специфичноста на RT-PCR

1. CND асинтеза:

Синтезата на cDNA на првата нишка може да се започне со користење на три различни методи, чија релативна специфичност влијае на количината и видот на синтетизираната cDNA.

Методот на случаен прајмер беше најмалку специфичен од трите методи.Прајмерите се анектираат на повеќе места низ транскриптот, генерирајќи кратки cDNA со делумна должина.Овој метод често се користи за да се добијат 5' крајни секвенци и да се добие cDNA од шаблони на РНК со региони на секундарна структура или со места за завршување кои не можат да се реплицираат со реверзна транскриптаза.За да се добие најдолгата cDNA, односот на прајмери ​​со РНК во секој примерок од РНК треба да се определи емпириски.Почетната концентрација на случајните прајмери ​​се движеше од 50 до 250 ng на 20 μl реакција.Бидејќи cDNA синтетизирана од вкупната РНК со користење на случајни прајмери ​​е примарно рибозомална РНК, поли(А)+РНК генерално се избира како шаблон.

Олиго(dT) прајмерите се поспецифични од случајните прајмери.Се хибридизира со поли(А) опашката која се наоѓа на 3' крајот на повеќето еукариотски mRNA.Бидејќи поли(А)+ РНК е приближно 1% до 2% од вкупната РНК, количината и сложеноста на cDNA е многу помала отколку кај случајните прајмери.Поради неговата висока специфичност, олиго(dT) генерално не бара оптимизација на односот на РНК со прајмери ​​и селекција на поли(А)+.Се препорачува да се користат 0,5μg олиго(dT) на 20μl систем за реакција.oligo(dT)12-18 е погоден за повеќето RT-PCR.Системот ThermoScript RT-PCR нуди oligo(dT)20 поради неговата подобра термичка стабилност за повисоки температури на инкубација.

Генски специфични прајмери ​​(GSP) се најспецифичните прајмери ​​за чекорот на обратна транскрипција.GSP е антисенс олигонуклеотид кој може специфично да се хибридира со целната секвенца на РНК, за разлика од случајните прајмери ​​или олиго(dT), кои се анелизираат на сите РНК.Истите правила што се користат за дизајнирање на PCR прајмери ​​се применуваат и за дизајнот на GSP во реакциите на обратна транскрипција.GSP може да биде иста низа како амплификација прајмер што се анелира до 3'-најкрајот на mRNA, или GSP може да биде дизајниран да се анелира низводно од прајмерот за обратно засилување.За некои засилени субјекти, треба да се дизајнираат повеќе од еден антисенс прајмер за успешна RT-PCR бидејќи секундарната структура на целната РНК може да го спречи врзувањето на прајмерот.Препорачливо е да се користи 1 pmol антисенс GSP во реакција на синтеза на првото влакно од 20 μl.

2. Зголемете ја температурата на инкубација за обратна транскрипција:

Со цел целосно да се искористи целосната предност на специфичноста на GSP, треба да се користи реверзна транскриптаза со поголема термостабилност.Термостабилните реверзни транскриптази може да се инкубираат на повисоки температури за да се зголеми строгоста на реакцијата.На пример, ако GSP се анелира на 55°C, специфичноста на GSP нема да биде целосно искористена ако AMV или M-MLV се користат за обратна транскрипција при ниска строгост од 37°C.Сепак, SuperScript II и ThermoScript може да се реагира на 50°C или повисоки, што ќе ги елиминира неспецифичните производи генерирани на пониски температури.За максимална специфичност, мешавината РНК/прајмер може да се пренесе директно од температурата на денатурација од 65°C до температурата на инкубација на обратна транскрипција и да се додаде во претходно загреана 2× реакциона мешавина (топол почеток на синтезата на cDNA).Ова помага да се спречи меѓумолекуларното спарување на базите при ниски температури.Повеќекратните температурни транзиции потребни за RT-PCR може да се поедностават со користење на термички циклус.

3. Ја намалува контаминацијата на геномската ДНК:

Потенцијална тешкотија што се среќава со RT-PCR е контаминацијата на геномската ДНК во РНК.Користењето на добар метод за изолација на РНК, како што е реагенсот Тризол, ќе го намали количеството на геномска ДНК што ја контаминира подготовката на РНК.За да се избегнат производите добиени од геномската ДНК, РНК може да се третира со DNase I со степен на засилување за да се отстрани контаминирачката ДНК пред обратна транскрипција.Дигестијата на DNase I беше прекината со инкубирање на примероците во 2,0 mM EDTA за 10 минути на 65 ° C.EDTA може да хелатира јони на магнезиум, спречувајќи ја хидролизата на РНК зависна од магнезиум јони на високи температури.

Со цел да се одвои засилената cDNA од контаминирачките производи за амплификација на геномската ДНК, може да се дизајнираат прајмери ​​кои секој ќе ги анелира за да ги одвои егзони.Производите на PCR добиени од cDNA ќе бидат пократки од оние добиени од контаминирана геномска ДНК.Дополнително, беше извршен контролен експеримент без обратна транскрипција на секој шаблон на РНК за да се утврди дали даден фрагмент е изведен од геномска ДНК или cDNA.Производот на PCR добиен без обратна транскрипција е изведен од геномот.