Real Time PCR, исто така познат како квантитативен PCR или qPCR, е метод за следење и анализа во реално време на производите за засилување на PCR.
Бидејќи квантитативната PCR ги има предностите на едноставна операција, брза и удобна, висока чувствителност, добра повторливост и ниска стапка на контаминација, таа е широко користена во медицинско тестирање, проценка на ефикасноста на лековите, истражување на генска експресија, трансгенско истражување, откривање на гени, откривање на патогени, детекција на животни и растенија., тестирање на храна и други области.
Затоа, без разлика дали сте ангажирани во основни истражувања во животни науки, или вработени во фармацевтски компании, компании за сточарство, компании за храна, па дури и вработени во влезно-излезни инспекции и карантински бироа, одделенија за мониторинг на животната средина, болници и други единици, ќе бидете повеќе или помалку изложени на Или треба да знаете знаење за совладување на квантитативна PCR.

Принцип на PCR во реално време

Real Time PCR е метод во кој флуоресцентните супстанции се додаваат во системот за реакција на PCR, а интензитетот на флуоресцентниот сигнал во процесот на PCR реакција се следи во реално време со помош на квантитативен PCR инструмент и на крајот се анализираат и обработуваат експерименталните податоци.

【Крива на засилување】е кривата што го опишува динамичкиот процес на PCR.Кривата на засилување на PCR всушност не е стандардна експоненцијална крива, туку сигмоидна крива.

[Фаза на платформа на кривата на засилување]Со зголемување на бројот на циклуси на PCR, инактивирање на ДНК полимеразата, трошење на dNTP и прајмери ​​и инхибиција на реакцијата на синтезата од реакцискиот нуспроизвод пирофосфат итн., PCR не секогаш се проширува експоненцијално., и на крајот ќе влезе во плато.

[Регион на експоненцијален раст на кривата на засилување]Иако фазата на плато варира многу, во одреден регион од регионот на експоненцијален раст на кривата на засилување, повторливоста е многу добра, што е многу важно за квантитативна анализа на PCR.

[Праг вредност и Ct вредност]Ја поставивме граничната вредност на детекцијата на флуоресценција на соодветната позиција во областа на експоненцијален раст на кривата на засилување, имено вредноста на прагот (Threshold).Пресекот на вредноста на прагот и кривата на засилување е вредноста Ct, односно вредноста Ct се однесува на бројот на циклуси (Threshold Cycle) кога ќе се достигне прагот.

Графиконот подолу јасно ја прикажува врската помеѓу прагот на линијата и кривата на засилување, прагот и вредноста на Ct.

【Како да се измери?】

Со математичка теорија е докажано дека вредноста на Ct има инверзна линеарна врска со логаритамот на бројот на почетни шаблони.Real Time PCR ги следи производите за засилување на PCR во реално време и ги квантифицира за време на фазата на експоненцијално засилување.

За секој циклус на PCR, ДНК се зголемуваше експоненцијално за 2 пати, и набрзо достигна плато.

Под претпоставка дека количината на почетна ДНК е А₀ , по n циклуси, теоретската количина на ДНК производ може да се изрази како:

A _n =A ₀ × 2ⁿ

Тогаш, колку е поголема почетната количина на ДНК A 0, толку побрзо количината на засилениот производ ја достигне вредноста за откривање An , а бројот на циклуси кога ќе се достигне An е вредноста на Ct.Односно, колку е поголема почетната количина на ДНК A 0, толку порано кривата на засилување достигнува врв, и соодветно потребниот број на циклуси n е помал.

Вршиме градиентно разредување на стандардот на позната концентрација и го користиме како шаблон за PCR во реално време, а ќе се добијат серија криви за засилување во еднакви интервали по редослед на почетна количина на ДНК од повеќе до помали.Според линеарната врска помеѓу вредноста Ct и логаритамот на бројот на почетни шаблони,[стандардна крива] може да се креира .

Со замена на Ct вредноста на примерокот со непозната концентрација во стандардната крива, може да се добие почетната количина на шаблонот на примерокот со непозната концентрација, што е квантитативниот принцип на Real Time PCR.

Метод на откривање на PCR во реално време

Во реално време PCR ги детектира производите за засилување на PCR со откривање на интензитетот на флуоресценција во системот за реакција.

Принцип на метод на вградување на флуоресцентна боја】

Флуоресцентни бои, како што е TB Green ® , може неспецифично да се поврзе со двоверижна ДНК во PCR системите и да флуоресцира при врзувањето.

Интензитетот на флуоресценција во системот на реакција експоненцијално се зголемува со зголемувањето на циклусите на PCR.Со детектирање на интензитетот на флуоресценцијата, количината на засилување на ДНК во реакциониот систем може да се следи во реално време, а потоа количината на почетниот шаблон во примерокот може да се процени обратно.

【Принцип на метод на флуоресцентна сонда】

флуоресцентна сондае низа на нуклеинска киселина со флуоресцентна група на 5' крајот и група за гаснење на 3' крај, која може конкретно да се врзе за шаблонот.Кога сондата е недопрена, флуоресценцијата што ја емитува флуорофорот се гаси од групата за гаснење и не може да флуоресира.Кога сондата ќе се распадне, флуоресцентната супстанција ќе се дисоцира и ќе емитува флуоресценција.

Во растворот за реакција на PCR се додава флуоресцентна сонда.За време на процесот на жарење, флуоресцентната сонда ќе се врзе за специфичната положба на шаблонот.За време на процесот на проширување, активноста на 5'→3' егзонуклеаза на ензимот PCR може да ја разложи флуоресцентната сонда хибридирана со шаблонот, а флуоресцентната супстанција се дисоцира за да емитува флуоресценција.Со откривање на интензитетот на флуоресценција на сондата во системот за реакција, може да се постигне целта за следење на количеството на засилување на PCR производот.

【Избор на метод за откривање на флуоресценција】

Ако се користи за да се разликуваат секвенци со висока хомологија и да се изврши детекција на мултиплекс PCR, како што е анализата на типирање SNP, методот на флуоресцентна сонда е незаменлив.
За други експерименти со PCR во реално време, може да се користи едноставен, лесен и евтин флуоресцентен химерски метод.

сонди Силна специфичност, способна за мултиплекс PCR

Недостаток

Барања за висока специфичност за засилување;

мултиплекс ПЦР не може да се изврши Треба да се дизајнираат специфични сонди, висока цена;

понекогаш дизајнот на сондата е тежок

Поврзани производи: