Директната PCR е реакција која директно користи животински или растителни ткива за засилување без екстракција на нуклеинска киселина.На многу начини, директната PCR работи како обична PCR

Главната разлика е прилагодениот пуфер што се користи во директна PCR, примерокот може директно да биде подложен на PCR реакција без екстракција на нуклеинска киселина, но постојат соодветни барања за толеранција на ензимите и компатибилноста на пуферот вклучен во директната PCR реакција.

Иако има повеќе или помалку PCR инхибитори во обичните примероци, директната PCR сепак може да постигне сигурно засилување под дејство на ензими и пуфери.Традиционалната PCR реакција бара висококвалитетна нуклеинска киселина како шаблон, која може да го инхибира непречениот напредок на PCR реакцијата доколку шаблонот содржи протеини и други нечистотии.Директниот PCR во моментов е една од најпопуларните технологии во областа на молекуларната дијагностика.

01 Директната ПЦР првично се користеше за животни и растенија

Најраната примена на директната ПЦР е во областа на животните и растенијата, како што се крвта, ткивото и влакната на стаорци, мачка, пилешко, зајак, овци, говеда, итн., лисја и семиња од растенија, итн., кои се користат за проучување на генотипизација, трансгенска, плазмидна детекција, анализа на генски нокаут, идентификација на ДНК извор и други видови SP, видови.

Овие полиња имаат некои заеднички карактеристики, односно содржината на целниот ген е релативно висока, а екстракцијата на нуклеинска киселина е проблематична, така што директното PCR не само што може да заштеди време и да има мало влијание врз резултатите, туку и да заштеди трошоци.

Директниот PCR што се користи за откривање на патоген е прашање од последниве години, некои производители на PCR реагенси направија многу напори во оваа насока кога прават иновации.Особено во оваа епидемија на COVID-19, на пазарот се појавија многу такви производи за откривање, како што е SARS-CoV-2 комплет за откривање нуклеинска киселина (Multiplex PCR флуоресцентна сонда метод) истражуван и развиен од Foregene, кој користи RT PCR технологија во реално време (rRT-PCR) за квалитативно откривање на човечка киселина или назоофична киселина. ал примероци од брис.

Foregene е една од компаниите кои користат Direct PCR технологија, за откривање на нормални ORF1ab, N, E иваријанта лоза на нуклеински киселини во примероци од човечки назофарингеален или орофарингеален брис, како што се SARS-CoV-2 B.1.1.7 лоза (Велика Британија), B.1.351 лоза (ZA), B.1.617 лоза (IND) и P.1 лоза (BR).

02  Реагенси потребни за директна PCR

Примерок Лизат

Примерокот за лизат може да се конфигурира сами или да се купи.Разликата во составот на различни марки лизати ќе ја направи способноста за лизирање различна, а потоа времето на лизирање ќе биде малку поинакво.На пример, за подготовка на примероци од животинско ткиво, генерално се препорачува лиза од 30 минути или преку ноќ, а растворот за лиза за вируси се движи од 3-10 минути.

PCR мастер микс

Се препорачува да се користи ДНК полимераза со топол старт за да се подобри специфичното засилување и да се зголеми способноста за засилување.Јадрото на директната PCR е високо толерантна полимераза.

Елиминирајте или инхибирајте компоненти во примерокот кои влијаат на засилувањето на ДНК

Откако примерокот ќе се обработи со лизатот, ќе се ослободат протеини, липиди и други клеточни остатоци, овие супстанции ќе ја инхибираат PCR реакцијата.Затоа, директното PCR бара додавање на соодветно отстранување или инхибитори за да се намали влијанието на овие фактори.

03  Збирка од пет точки на знаење за директна PCR

Прво, Direct PCR технологијата е директна PCR технологија за различни биолошки примероци.Под оваа техничка состојба, нема потреба да се одвојува и екстрахира нуклеинската киселина, директно да се користи примерокот од ткиво како објект и да се додадат прајмерите на целните гени за да се изврши PCR реакцијата.

Второ, директната PCR технологија не е само традиционална технологија за засилување на шаблоните на ДНК, туку вклучува и PCR за обратна транскрипција на шаблон РНК.

Трето, директната PCR технологија не само што директно врши рутински квалитативни PCR реакции на ткивните примероци, туку исто така вклучува и qPCR реакции во реално време, што бара од системот за реакција да има силна анти-позадинска флуоресцентна интерференција способност и ендогената флуоресценција ја угаснува антагонистичката способност.

Четврто, на примероците насочени со Direct PCR технологијата им е потребно само ослободување на шаблони на нуклеинска киселина и не отстрануваат протеини, полисахариди, јони на сол итн. кои се мешаат во PCR реакцијата.За што е потребно полимеразата на нуклеинската киселина и PCR Mix во реакциониот систем да имаат одлична отпорност и приспособливост за да се обезбеди ензимска активност и точност на репликација во сложени услови.

Петто, примерокот од ткиво насочен со Direct PCR технологијата без третман за збогатување на нуклеинска киселина и количината на шаблонот е многу мала, што бара системот за реакција да има исклучително висока чувствителност и ефикасност на засилување.