Почетен материјал: РНК
Квантитативната реверзна транскрипција PCR (RT-qPCR) е експериментален метод кој се користи во експериментите со PCR користејќи РНК како почетен материјал.Во овој метод, вкупната РНК или гласник РНК (mRNA) прво се транскрибира во комплементарна ДНК (cDNA) со реверзна транскриптаза.Последователно, беше изведена qPCR реакција со користење на cDNA како шаблон.RT-qPCR се користи во различни апликации за молекуларна биологија, вклучително и анализа на генска експресија, валидација на интерференција на РНК, валидација на микросреди, детекција на патогени, генетско тестирање и истражување на болести.
Методи во еден чекор и два чекора за RT-qPCR
RT-qPCR може да се постигне со метод во еден или два чекора.Едностепениот RT-qPCR комбинира обратна транскрипција и PCR засилување, дозволувајќи им на обратна транскриптаза и ДНК полимераза да ја завршат реакцијата во истата цевка под исти тампон услови.RT-qPCR во еден чекор бара само употреба на прајмери специфични за секвенцата.Во двостепен RT-qPCR, обратна транскрипција и PCR засилување се изведуваат во две цевки, користејќи различни оптимизирани бафери, услови на реакција и стратегии за дизајнирање на прајмер.
| Предност | Недостаток | |
| Еден чекор | Овој метод има помалку експериментални грешки бидејќи и двете реакции се прават во една цевка
Помалку чекори со пипетирање го намалуваат ризикот од контаминација
Погоден за засилување/скрининг со висок пропус, брз и репродуктивен | Реакциите во два чекора не можат да се оптимизираат одделно
Бидејќи условите за реакција се компромитирани со комбинирање на реакцијата во два чекора, чувствителноста не е толку добра како онаа на методот во два чекора
Бројот на цели откриени од еден примерок е мал |
| Два чекори | Способност да се создадат стабилни cDNA библиотеки кои можат да се складираат долги временски периоди и да се користат во повеќе реакции
Целните гени и референтните гени може да се засилат од истата cDNA библиотека без потреба од повеќе cDNA библиотеки
Реакциони бафери и услови на реакција кои овозможуваат оптимизација на единечни реакциски циклуси
Флексибилен избор на услови за активирање | Користењето на повеќе цевки и повеќе чекори за пипетирање го зголемува ризикот од контаминација на ДНК, и одземаат многу време.
Потребна е поголема оптимизација од методот во еден чекор |
Поврзани производи:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Еден чекор)-SYBR Зелено I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Еден чекор)-Taqman
RT Easyᵀᴹ I Master Premix for First-Strand CDNA Synthesis
Комплет Easyᵀᴹ-SYBR Green I PCR во реално време
ПЦР во реално време Easyᵀᴹ-Taqman
Избор на вкупна РНК и мРНК
При дизајнирање на RT-qPCR експеримент, важно е да се одлучи дали да се користи вкупна РНК или прочистена mRNA како образец за обратна транскрипција.Иако mRNA може да обезбеди малку поголема чувствителност, вкупната РНК сè уште често се користи.Причината за ова е што вкупната РНК има поважна предност како почетен материјал од mRNA.Прво, процесот бара помалку чекори за прочистување, што обезбедува подобро квантитативно обновување на шаблонот и подобра нормализација на резултатите до почетниот број на ќелии.Второ, го избегнува чекорот на збогатување на мРНК, што може да ја избегне можноста за искривени резултати поради различните обновувања на различни мРНК.Севкупно, бидејќи во повеќето апликации релативната квантификација на целниот ген е поважна од апсолутната чувствителност на детекцијата, вкупната РНК е посоодветна во повеќето случаи.
Прајмер за обратна транскрипција
Во методот во два чекора, може да се користат три различни методи за да се подготви реакцијата на cDNA: олиго(dT) прајмери, случајни прајмери или прајмери специфични за секвенцата.Типично, олиго(dT) прајмери и случајни прајмери се користат во комбинација.Овие прајмери се анектираат на шаблонот mRNA и обезбедуваат реверзна транскриптаза со почетна точка за синтеза.
| Избор на прајмер | Структура и функција | Предност | Недостаток |
| Олиго(dT) прајмер (или закотвен олиго(dT) прајмер) | Проширено жарење на остатоци од тимин на поли(А) опашката на mRNA;сидро олиго(dT) прајмер содржи G, C или A на крајот од 3' (место за прицврстување) | Синтеза на cDNA со целосна должина од mRNA со поли(А) опашка
Применливо кога има помалку почетен материјал
Местото на закотвување осигурува дека олиго(dT) прајмерот се врзува за 5' поли(А) опашката на mRNA | Погоден само за засилување на гени со поли(А) опашки
Добијте cDNA скратена од местото за прајминг*2 во поли(А)
Пристрасен да се врзува за 3' крајот*
*Оваа можност е минимизирана ако се користат закотвени олиго(dT) прајмери |
| случаен прајмер
| 6 до 9 бази во должина, кои можат да се анектираат на повеќе места за време на транскрипцијата на РНК | Анелирање на сите РНК (tRNA, rRNA и mRNA)
Погоден за транскрипти со значителна секундарна структура или кога има помалку почетен материјал
Висок принос на cDNA | cDNA е обратно транскрибирана од целата РНК, што обично не е посакувано и може да го разреди сигналот на целната mRNA
добие скратена cDNA |
| прајмери специфични за низа | Прилагодени прајмери кои таргетираат специфични секвенци на mRNA | специфична cDNA библиотека
Подобрете ја чувствителноста
Користење на обратни qPCR прајмери | Ограничено само на синтезата на еден целен ген |
Обратна транскриптаза
Обратна транскриптаза е ензим кој користи РНК за синтеза на ДНК.Некои реверзни транскриптази имаат активност на RNase и можат да ги разградат нишките на РНК во хибридните нишки на РНК-ДНК по транскрипцијата.Ако нема RNase ензимска активност, RNaseH може да се додаде за поголема qPCR ефикасност.Најчесто користените ензими вклучуваат обратна транскриптаза на вирусот на леукемија на глувчето Moloney и реверзна транскриптаза на вирусот на птичји миелобластом.За RT-qPCR, идеално е да се избере реверзна транскриптаза со поголема термостабилност, така што синтезата на cDNA може да се изврши на повисоки температури, обезбедувајќи успешна транскрипција на РНК со повисока секундарна структура, додека ја одржуваат нивната целосна активност во текот на реакцијата, што резултира со повисоки приноси на cDNA.
Поврзани производи:
Foreasy M-MLV обратна транскриптаза
RNase H активност на реверзна транскриптаза
RNaseH може да ги разградува нишките на РНК од дуплексите на РНК-ДНК, што овозможува ефикасна синтеза на двоверижна ДНК.Меѓутоа, кога се користи долга mRNA како шаблон, РНК може да се разгради предвреме, што резултира со скратена cDNA.Затоа, често е корисно да се минимизира активноста на RNaseH за време на клонирање на cDNA ако се сака синтеза на долги транскрипти.Спротивно на тоа, реверзните транскриптази со активност на RNase H често се корисни за qPCR апликации бидејќи го подобруваат топењето на РНК-ДНК дуплексите за време на првиот циклус на PCR.
Дизајн на прајмер
PCR прајмерите што се користат за чекорот qPCR во RT-qPCR идеално треба да бидат дизајнирани да опфаќаат спој на егзон-ексон, каде што буквар за засилување потенцијално би можел да ја опфаќа вистинската граница на егзон-интрон.Бидејќи секвенците на геномска ДНК што содржат интрон не се засилени, овој дизајн го намалува ризикот од лажни позитиви засилени од контаминирана геномска ДНК.
Ако прајмерите не можат да бидат дизајнирани за да ги раздвојуваат егзони или границите на егзон-ексон, може да биде неопходно да се третираат примероците на РНК со DNase I или dsDNase без RNase за да се отстрани геномната ДНК контаминација.
Контрола на RT-qPCR
Негативната контрола на обратна транскрипција (-RT контрола) треба да биде вклучена во сите RT-qPCR експерименти за да се открие контаминација на ДНК (како геномска ДНК или PCR производи од претходни реакции).Оваа контрола ги содржи сите компоненти на реакцијата освен реверзна транскриптаза.Бидејќи со оваа контрола не се случува обратна транскрипција, доколку се забележи засилување на PCR, најверојатно е контаминација од ДНК.
Време на објавување: 02.08.2022
